响应面法优化辣蓼黄酮的提取工艺

张 文，胡庭俊，于美玲

（ 广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005 ）

中草药辣蓼为蓼科蓼属植物，广泛分布于我国南北各省区，资源丰富，开发利用潜力大[1]。辣蓼的主要生物活性成分为黄酮类化合物，如金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素等[2]，具有抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等多种功效，且安全性能高[3-5]。

不同植物所含黄酮类化合物的种类及含量差异较大，因此从不同植物中提取黄酮类化合物的研究备受关注。实验室常用于优化提取工艺的方法很多，包括单因素试验、正交试验[6]、Box-Behnken 响应面试验等[7]。与其他方法相比，响应面法更准确高效，考虑到了试验的随机误差，在寻求最优结果时对各个因素进行连续性分析，因而广泛应用于中药成分提取方面[8]。基于此，本试验采用单因素法和Box-Behnken 响应面法，优化提取过程中的液料比、乙醇含量、超声时间，以期为辣蓼黄酮生产应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药物辣蓼购自广西壮族自治区玉林市中药市场。芦丁标准品（纯度≥98%）购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 主要仪器

SB-5200DTDN 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、UV-1750紫外分光光度计（岛津公司）、CDUPT-1纯水仪（成都纯越科技有限公司）、EL204分析天平（METTLER TOLEDO）、HEI VAP ADVANTAGE 旋转蒸发仪（海道夫公司）、Himac CF16RN多用途冷冻离心机（日立公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 总黄酮含量测定

标准曲线建立：称取芦丁标准品10.0 mg，用60%乙醇定容至50.0 mL，制成0.2 g/L芦丁标准溶液。

标准曲线绘制：将0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL芦丁标准溶液加入10 mL容量瓶中，按照亚硝酸钠—硝酸铝—氢氧化钠法测定510 nm处的吸光度。以芦丁作为参照物计算辣蓼的总黄酮含量。

总黄酮含量=(C×V×n)/m×100%（1）

式中：C表示提取液中黄酮含量（g/mL）；V表示提取液体积（mL）；n表示提取液稀释倍数；m表示辣蓼黄酮提取物的质量（g）。

1.2.2 改良醇提法提取辣蓼总黄酮

准确称取10.0 g辣蓼粉末，按照一定的料液比、乙醇含量、超声时间和超声温度进行提取。将辣蓼粉末浸泡0.5 h，45 ℃超声40 min，80 ℃水浴锅加热1.5 h，过滤。将滤渣加入乙醇溶液后再次水浴，重复3 次后合并滤液，以20～25 μm 定性滤纸抽滤，旋转蒸发至50 mL，冷冻干燥48 h后即得辣蓼黄酮提取物。根据《中华人民共和国药典法》委员会规定的紫外分光光度法，在510 nm波长处测定吸光度。

1.2.2.1 单因素试验

根据1.2.2 提取方法的参数进行液料比的选择。固定乙醇浓度60%、超声温度40 ℃、超声时间40 min，探究不同液料比（5、10、15、20、25 mL/g）对总黄酮含量的影响。

根据1.2.2 提取方法的参数进行乙醇浓度的选择。固定液料比20 mL/g、超声温度40 ℃、超声时间40 min，探究不同的乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%）对总黄酮含量的影响。

根据1.2.2 提取方法的参数进行超声时间的选择。固定液料比20 mL/g、乙醇浓度60%、超声温度40 ℃，探究不同的超声时间（30、40、50、60、70 min）对总黄酮含量的影响。

根据1.2.2 提取方法的参数进行超声温度的选择。固定液料比20 mL/g、乙醇浓度60%、超声时间40 min，探究不同的超声温度（20、30、40、50、60 ℃）对总黄酮含量的影响。

1.2.2.2 响应面试验

根据单因素试验结果，以液料比（A）、乙醇含量（B）、超声时间（C）为试验因素，总黄酮含量为指标，进行响应面试验。试验设计见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平设计Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线（见图1）

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

由图1 可知，回归方程为y=4.057 1x+0.001 6，R2=0.990 2，线性关系良好。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 液料比对总黄酮含量的影响（见图2）

图2 液料比对总黄酮含量的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoid content

由图2可知，在乙醇含量、超声时间和超声温度一定的条件下，当液料比由5 mL/g 提高至20 mL/g 时，总黄酮含量随之增加。分析原因是当液料比小于20 mL/g 时，料液比越高，传质过程越快，越利于黄酮的提取；当液料比大于20 mL/g时，总黄酮含量相对稳定，可能是黄酮已被最大限度提取。由此可知，液料比为20 mL/g 时可在获得较高黄酮含量的同时减少溶剂的消耗。因此，选择15、20、25 mL/g作为响应面试验的因素水平。

2.2.2 乙醇含量对总黄酮含量的影响（见图3）

图3 乙醇含量对总黄酮含量的影响Fig.3 Effect of ethanol content on total flavonoid content

由图3可知，在其他3个因素一定的条件下，当乙醇含量由10%提高至60%时，总黄酮含量随之增加；乙醇含量高于60%时，总黄酮含量呈下降趋势。因此，选择50%、60%、70%作为响应面试验的因素水平。

2.2.3 超声时间对总黄酮含量的影响（见图4）

图4 超声时间对总黄酮含量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on total flavonoid content

由图4可知，在液料比、乙醇含量和超声温度一定的条件下，超声时间为30～40 min 时，总黄酮含量上升，40 min达到峰值，之后急剧下降，在50～70 min 趋于平缓。因此，选择30、40和50 min作为响应面试验的因素水平。

2.2.4 超声温度对总黄酮含量的影响（见图5）

图5 超声温度对总黄酮含量的影响Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on total flavonoid content

由图5可知，在液料比、乙醇含量和超声时间一定的条件下，超声温度在20～60 ℃时，总黄酮含量趋于平缓，其中超声温度在40 ℃时总黄酮含量最高。因此，将超声温度设定为40 ℃，考察其他变量。

2.3 响应面优化试验结果

采用Box-Behnken设计试验，以液料比（A）、乙醇浓度（B）和超声时间（C）为自变量，总黄酮含量为因变量，响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验结果Tab.2 Box-Behnken experimental results

2.3.1 多元二次回归方程

总黄酮含量（Y）与试验因素的回归方程：Y=19.03+1.39A+0.758 8B+1.45C-0.407 5AB-1.3AC-0.74BC-2.61A2-1.91B2-1.3C2

该回归方程模型中，F值=233.33，P＜0.01，表明模型的整个回归区域拟合很好；P＞0.05，表明相对于纯误差差异无统计学意义，R2=0.996 7，表明试验相关性较好，能够使用此模型对总黄酮含量进行分析和预测，结果见表3。

表3 回归模型的方差分析Tab.3 Analysis of variance for regression mode

由表3 可知，各因素对总黄酮含量大小的影响依次是A＞B＞C，液料比和乙醇含量对总黄酮含量的影响达到极显著水平，超声时间不显著；A2、B2和C2影响极显著。

2.3.2 各因素交互作用对总黄酮含量的影响（见图6）

图6 各因素交互作用对总黄酮含量的影响Fig.6 Effect of interaction of various factors on total flavonoid content

响应面坡度越陡峭，表示相应的响应值对相关条件越为敏感，该因素对总黄酮含量影响越大。

由图6 可知，A和C之间交互作用对总黄酮含量影响最明显，与方差分析中回归模型系数显著性检验结果一致。三者之间的等高线呈椭圆形，表明各因素两两之间交互作用显著。

2.3.3 最佳提取条件及验证试验

利用Design-Expert软件对提取工艺参数进行优化，得到最佳工艺参数为：液料比21.430 mL/g、乙醇含量61.955%、超声时间38.592 min，预测总黄酮含量为19.292%。为方便试验操作，将优化后的工艺条件四舍五入为液料比21 mL/g、乙醇含量62%、超声时间39 min，试验重复3次，结果见表4。

由表4 可知，在上述条件下得到总黄酮的平均含量为19.108%，与预测值接近，表明优化的工艺参数准确可靠，具有实用价值。

3 讨论

辣蓼广泛分布于我国广西、湖南、贵州等地区，具有良好的抗氧化效果。辣蓼富含的黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的植物次级代谢产物，在植物界中广泛存在[9]。黄酮类化合物不仅影响植物的生长发育，而且还具有抗病毒和抗氧化等多种活性[10]。

吴永玲等[11]研究表明，响应面法优化提取的蛇床子总黄酮不仅对苹果黄蚜和朱砂叶螨的48 h 校正死亡率均大于50%，且对苹果腐烂病菌和油菜菌核病菌也具有较强的抑菌活性。李克香等[12]试验表明，超声波酶法辅助提取的紫萁黄酮能够有效清除自由基，且清除率呈剂量依赖性。苏慧慧等[7]研究发现，采用单因素结合Box-Behnken 响应面法提取的三叶木通总黄酮对DPPH自由基的清除率与维生素C接近，抗氧化活性作用较高。王振伟等[13]提取的线叶金雀花总黄酮作用于大肠杆菌后，大肠杆菌的生长对数期消失，细胞形态出现明显损伤，抑菌效果显著。龙林等[14]优化提取的青稞秸秆总黄酮对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用。

目前，提取黄酮的方法有酶解法、醇提法、水提法、超声提取法、微波提取法等[15]，但单一提取方法效率较低。因此，本试验结合醇提法和超声法，在醇提的基础上将超声波提取作为提取手段，具有高效率、操作简单、对设备要求低等优点。在单因素试验基础上，结合响应面法优化提取工艺，利用统计学试验方法找出各因素水平的最佳条件[16]，得到多元二次回归模型，计算出最优条件，优化工艺可靠，具有重复性。结果表明，试验建立的方法不仅能够提高总黄酮的含量，还可减少试验成本，操作简便，为辣蓼黄酮的研究及开发提供一定参考。

4 结论

本研究结果表明，优化后最佳工艺为料液比21 mL/g、乙醇含量62%、超声时间39 min，超声温度40 ℃，此条件下制备的总黄酮平均含量为19.108%，提取工艺稳定，重现性良好。本试验为辣蓼黄酮的提取提供了新思路，可为进一步研究发掘辣蓼黄酮的药理作用及深入开发利用辣蓼黄酮提供理论依据和实践参考，也可为其他植物中黄酮的提取提供有益参考。