生物囊泡分离鉴定方法及其在兽医学中的应用

贾万欣，邹 聪，段琦颖，屈春惠，肖楚宁，李 斌，王世民

（ 新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052 ）

生物囊泡（biological vesicles）是细胞在质膜出芽、起泡等过程分泌产生后被释放的一种亚细胞组分，其实质是纳米颗粒。近年来，外泌体、凋亡小体及微囊泡等微粒均在生物囊泡研究范畴[1-2]。生物囊泡内部含多种如核酸、蛋白、脂质等生物活性分子，在机体各种体液中广泛存在，是公认的液体活检类别中不断发展的生物标志物。最初，生物囊泡被认为是细胞碎片和废物颗粒，且不具有自我分裂与增殖能力。但随着科学技术进步，研究指出生物囊泡通过运输细胞间的信号分子而在细胞通信中发挥关键作用。越来越多研究表明，生物囊泡参与了机体各种生理及病理活动，在动物的疾病诊断及疫苗研制方面均有涉足。

截至目前，人们对生物囊泡的类型、分离及鉴定技术已有一定了解，国内外关于囊泡的报道也较多。多项研究表明，生物囊泡在细胞存活与凋亡、疾病诊疗及疫苗方面具有广阔的应用与研究前景，在相关领域的研究中发挥了重要作用。生物囊泡基于动物应用的研究体现在存在哺乳动物乳汁中，主要是对不同动物乳汁中外泌体miRNA异同点的研究。被外泌体包裹的miRNA经过幼畜消化道乃至通过血液循环运至免疫器官调控机体免疫机制，为幼畜提供免疫保护，该过程中囊泡的数量与质量便关乎研究的成败[3-4]。查阅文献发现，在没有外界因素诱导下，机体单位时间内产生的生物囊泡数量少且不纯，导致生物囊泡的研究受到限制。于是在现有技术下对囊泡进行特殊处理令其大量增值，之后进行分离与纯化成为解决该瓶颈的一种有效途径。汇总相关文献结果显示，仅通过单一方法分离所得囊泡的纯度和产量通常难以满足试验要求，大多数情况下会同时联用至少两种方法处理，蛋如何高效、快速地提取囊泡，且保持形态结构和功能的完整性从而使其得到更广泛的应用仍有待探究。本文就生物囊泡的类型、分离纯化方法、鉴定技术及其在兽医学中的应用等方面进行综述，以期为生物囊泡应用于兽医临床诊疗提供参考。

1 生物囊泡的概述

1.1 生物囊泡的发展

生物囊泡是指某些两亲性的小分子，在水中分散时形成的一类在结构上具有磷脂封闭双层的有序簇体，一般也被称作脂质体。研究者1946 年首次于血浆中发现囊泡的存在，起初它被定义为一种“因子”物质，具有加速血栓形成的作用[5]。之后Wolf[6]研究血小板在血浆中的作用时发现了一种能够活化血小板的微粒，命名为“血小板尘埃”。1983年，Pan等[7]在研究中发现，绵羊红细胞内的代谢物通过一些小囊泡被释放至细胞外，随即将其命名为外泌体。生物囊泡在机体体液中广泛存在，其作为异质性较大的群体，来源众多，命名也各有不同，且与多种生理病理反应密切相关，在生物应用中存在巨大潜力。

1.2 生物囊泡的分类

1.2.1 外泌体

外泌体是由细胞分泌且具有磷脂双分子层的生物囊泡，通过出芽的方式与质膜融合从而释放至细胞外，直径约为30～100 nm，广泛分布于血液、唾液、母乳和脂肪组织等在内的体液和组织中，内含DNA、mRNA、miRNA 和胞质蛋白等多种物质[8]。外泌体通常通过融合受体细胞膜或结合靶细胞膜表面受体的方式完成细胞间信号的传导，从而调节机体生理及病理活动。此外，外泌体在肿瘤疾病研究及免疫反应中亦扮演重要角色。

1.2.2 微囊泡

微囊泡是由细胞膜出芽形成的膜性细胞器，尺寸大小不均一，直径一般为100～1 000 nm，内部含有蛋白质、脂质及核酸等物质，其表面虽具有多种蛋白质的附着却没有特定的表面分子标记，且不同来源的微囊泡发挥的生物学功能也不尽相同[9]。已有文献表明，微囊泡参与多种疾病的研究及诊疗，如治疗骨质疏松、肿瘤细胞的相关研究及预后等方面均发挥良好作用，与其他类型的囊泡一样可作为细胞间通讯的介质，成为新型天然药物传递载体[10]。因微囊泡最终是由质膜脱落而成，故也称为“脱落囊泡”。

1.2.3 凋亡小体

凋亡小体是从细胞质膜脱落或萌芽释放形成的生物囊泡，其形成过程较简易，整个细胞通过发芽、起泡在质膜出形成泡体，最终自发脱落形成大小不一的凋亡小体，其内部含有含胞质、细胞器和核碎片等物质，可通过运输生物分子帮助完成细胞清除以及细胞间通信等工作[11-13]。有研究表明，凋亡小体中也含有DNA 且能够水平传递DNA如致癌基因，发挥免疫抑制作用。与外泌体和微囊泡相比，凋亡小体是较大的囊泡，一般直径为800～5 000 nm。凋亡小体不仅具有转移致癌因子促进肿瘤形成的作用，还具有促进免疫系统的激活、垂死细胞的募集以及受损组织的再生等功能。

2 生物囊泡的分离纯化技术

生物囊泡分离与纯化技术不完善是制约相关研究和临床诊疗发展的瓶颈问题之一。使用不同分离方法分离直接影响生物囊泡的纯度和浓度，因此，多种方法间可互相结合，各取优势，从而提高生物囊泡的产量与质量。目前，常见的生物囊泡分离技术主要有差速离心、亲和层析、密度梯度、超滤和尺寸排阻色谱等，可根据研究目的的需要选择最优的技术进行分离纯化[14-15]。

2.1 差速离心

差速离心技术是最常见且使用最广的生物囊泡分离纯化方法，被视为生物囊泡提取的“金标准”，是基于生物囊泡大小、密度不同从而达到分离的目的。在前人不断进行技术优化的过程中发现，差速离心技术的关键在于由低到高、循序渐进提高离心力，分步去除死细胞、细胞碎片等杂质，最终通过100 000×g的离心以实现生物囊泡与其他更小的颗粒及可溶性物质的分离[16-17]。研究发现，使用差速离心技术纯化生物囊泡的过程中，离心机配置、向心力、离心时间、转子类型及各种参数均对囊泡的产量和纯度具有直接影响。迄今为止，差速离心技术较为成熟，不需要进行额外标记，能够有效避免操作过程中交叉污染的发生。通过此法能够有效去除大部分杂质，但分离过程较为耗时且操作烦琐，分离到的生物囊泡常出现形态不完整、聚集成块等不利于后续组分分析的现象。Kontopoulou等[18]和Campoy等[19]通过该技术分别在血浆和子宫内含物中成功分离出生物囊泡。

2.2 密度梯度离心

由于不同类型囊泡的粒径大小和密度皆存在差异，密度梯度离心技术以此为依据对生物囊泡进行分离，一般情况下使用蔗糖或碘克沙醇作为介质进行处理。密度梯度离心技术通常与差速离心技术联用从而提高生物囊泡的纯度，先使用差速离心去除大颗粒物质，之后使用密度梯度离心去除蛋白质的污染，达到进一步纯化生物囊泡的效果[20]。Iwai等[21]通过使用密度梯度离心技术从人唾液中分离得到形态完整的囊泡。与差速离心技术相比，密度梯度离心技术更具优势，回收率约10%～50%，能够有效减少蛋白质及其他颗粒的污染；但由于该方法使用的介质黏度较高，会降低生物囊泡的沉降速率，导致分离纯化过程存在耗时长、操作复杂、不适用于临床应用等缺点。研究人员可根据试验所需，选择一种或多种方法组合进行生物囊泡的分离纯化[22-24]。

2.3 亲和层析

生物囊泡的膜表面存在丰富的蛋白质，利用抗原和抗体之间的免疫亲和作用以及受体和配体之间的特异性反应，为囊泡的分离提供了一种新的途径[25]。亲和层析是基于柱子（Beads）或芯片等单克隆抗体作为载体，从而捕获表面具有特异性蛋白的囊泡。Beads 的质量、洗脱条件以及操作人员的熟练程度均与最终获取囊泡的纯度与产量密切相关。与前两种分离方法相比，亲和层析技术改进了耗费大量样品却分离效率低的缺陷，可精确地从更少的样品中分离出囊泡，还可应用于后续囊泡的定性及定量分析[26]。研究表明，利用抗体包被的磁珠对特异性抗原进行囊泡分离，所获取的囊泡纯度较高且结构形态完整，但该技术不适用于大量囊泡分离，且由于磁珠、抗体价格较为昂贵，令不少研究人员望而止步[27-28]。

2.4 超滤

超滤是利用多孔膜分离溶液中大小不同的物质颗粒，研究人员可通过调节滤膜孔径大小筛选出囊泡的不同子集[29]。使用该技术分离囊泡时，需另外施加外力或离心力，但施加外力易改变囊泡形态，使体积比滤孔膜径大的囊泡透过滤膜，引起污染。其次，与囊泡大小相似的纳米颗粒也可透过滤膜是超滤技术的一大缺陷，因此可结合超滤技术与其他分离技术以减少污染[30-31]。超滤技术在分离时间上具有优势，并且处理样本体积大，回收率可观，适用于临床上分离和浓缩囊泡。

2.5 尺寸排阻色谱

尺寸排阻色谱是基于分离物质的大小或分子量大小，使用特定柱料进行分离的色谱方法[32]。利用尺寸排阻色谱进行囊泡分离，其优势在于可保护囊泡形态和生物学结构不受破坏，囊泡回收率较高，操作便捷且价格较为低廉；但由于柱料的选择较少，仍会存在如蛋白质等大颗粒的污染，降低囊泡的纯度。有研究表明，联合使用多种分离技术较单一使用某种分离技术所获取的囊泡更多，纯度更高。Benedikter 等[33]研究发现，结合超滤与尺寸排阻色谱两种方法可提高生物囊泡的产量及纯度。

2.6 试剂盒法

试剂盒法即利用商用试剂盒按照操作流程完成囊泡分离的技术。目前市场上已有多种基于上述传统分离技术的试剂盒，如exoEasy Max 试剂盒、MagCapture™试剂盒、Minute™、ExoQuick®试剂盒等，不同试剂盒依据不同的分离原理，所能达到的分离效率及质量也各有差异[34-35]。经综合分析表明，使用商品化试剂盒进行囊泡提纯具有操作简便、省时、囊泡完整性高等优势，但由于市面上已授权的商用试剂盒质量不均，导致生物囊泡提取的产量及纯度参差不齐。迄今为止，尚无任何一款应用于囊泡分离纯化的试剂盒兼顾多项优点，均存在价格昂贵、分离效率低下等不足。

3 生物囊泡的鉴定及分析技术

3.1 显微成像技术

显微成像技术被广泛应用于生物囊泡的鉴定研究中，是鉴定生物囊泡形成的有力工具，不同的显微成像系统由于分辨率的受限所获得的成像效果参差不一。通过显微成像可快速展示囊泡的形态、大小、粒子直径和浓度等物理特性，然而该技术对样品的制备要求严苛，样品浓度高，并且存在视野范围有限、检测通量较低等不足，仅能够满足囊泡的初步表征需求[36]。

扫描电镜、透射电镜、冷冻电镜及原子力电镜是常用于囊泡显微成像的设备。扫描电子显微镜作为最广泛的细胞表面形貌成像工具，常用于囊泡的表面结构成像信息的采集，由于该设备采集时需保持严格的真空条件，囊泡样品处于脱水的状态，因此在扫描电镜下呈蝶形或杯状。与扫描电镜相比，透射电镜具有更高的分辨率，在获取囊泡基本形貌特征的基础上结合免疫胶体金技术可进一步分析囊泡表面的蛋白质[37]。冷冻电镜是将样品通过快速冷冻技术进行固定，在低温条件下进行高分辨率的观察。与前两种技术相比，该技术无须对囊泡样品进行前期染色、固定及干燥等可能会引起囊泡结构变化的操作，使囊泡维持原始结构[38]。原子力显微镜是一种通过探针与样品接触反馈信号成像的原子级成像分辨率的成像技术，不仅可展现囊泡的外观形态，更能够揭示囊泡的脂质、蛋白质等精细的结构[39]。

3.2 纳米颗粒跟踪分析

纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）是一种较为先进的、可用于测定样本中颗粒的粒径大小与浓度高低的技术，该技术可精准测定直径低于30 nm 的小型囊泡并对其进行表征分析，操作过程简便快速，样品不需要固定、干燥等前期处理步骤，直接在液相中进行检测，可在不破坏囊泡本身结构的前提下完成鉴定。目前，NTA 不仅可在散射模式下进行检测，还能够通过染料及荧光标记抗体的方法实现囊泡的表征分析[40]。但在使用NTA检测分析过程中，仪器仅在二维平面对颗粒进行追踪分析，但实际上颗粒的布朗运动是在三维空间发生，在二维的平面进行三维运动的分析会导致测量结果不准确。因此，通常使用NTA测得的囊泡粒径大小相比电镜测得的结果偏大[41]。

3.3 流式细胞术

生物囊泡的直径较小且成分多样，现有的鉴定技术难以实现单个囊泡的多种生物化学性状的分析，有碍囊泡的研究和发展。流式细胞术是一种高通量、多参数，应用于悬液中微小颗粒快速定量分析的先进技术，可根据囊泡的大小或所携带的荧光信号对粒子进行分选[42-43]。流式细胞仪的灵敏度较低，粒径小或荧光亮信号低的囊泡难以检测且会引入背景干扰。因此，研究人员常使用脂膜染色或荧光标记的手段以区分背景信号。光散射是对无标记囊泡检测最高效的手段，囊泡的粒径大小及疏密程度主要通过其散射光进行分析，而单个囊泡的散射光强度极其微弱，常低于背景信号，不利于检测。目前，找到一种通用的荧光染料对囊泡进行标记以削弱背景噪声的干扰成为提高流式细胞术检测限的重要突破点[44]。

3.4 蛋白质鉴定

生物囊泡内含有蛋白质、活性核酸和脂质等物质，而蛋白质作为生物学功能的执行者，对其进行研究及分析利于深入了解囊泡的分泌和分选机制。囊泡的蛋白质分为非特异性蛋白质和特异性蛋白质，这些蛋白质主要来自细胞膜、细胞质中的细胞器等[45]。囊泡的蛋白质组成与细胞和疾病的种类相关，不同的蛋白质组成使囊泡具有不同的生物学特性，鉴定囊泡蛋白的组成有助于研究相关蛋白质在疾病发展进程中的作用，并可将其作为疾病早期诊断和预后评估的生物标志物。蛋白免疫印迹法（western blot，WB）和酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是囊泡蛋白质传统的鉴定方法，均为生物科学中较为成熟的蛋白质分析技术。目前，绝大多数的文章中均采用WB 进行蛋白质的定量分析与鉴定，CD9、CD63、CD81、Alix等蛋白常作为囊泡标志性蛋白，该法操作复杂烦琐，但可鉴定多种蛋白质[46-48]。ELISA是使用“双抗体夹心”法进行囊泡蛋白质的鉴定，因该方法需要一对抗体进行检测，很大程度上提高了检测的特异性，但同时也增加了鉴定的成本。因此，该方法不作为囊泡蛋白质分析的最优选择。

除上述传统蛋白质鉴定技术外，越来越多基于新型生物传感技术且具有高度特异性、敏感性的生物传感器被用于囊泡的蛋白质分析与检测工作，这些技术拥有检测高通量、方便快速、灵敏性强等优点，因而比传统的蛋白质检测方法更具优势，适用于临床检验。近年来，基于微流控技术检测囊泡蛋白质的方法不断兴起，因其操作简便且可在微尺度对流体进行检测，成为新型检测技术的新起之秀。

3.5 核酸鉴定

在囊泡的组成中，核酸是除蛋白质外的另一种重要的组成物质，因此也成为目前学术界的研究热点之一。囊泡中的核酸物质以RNA 为主，包括miRNA、tRNA、rRNA 等非编码RNA，且大部分被包裹在囊泡内部。已有研究证明了囊泡中的核酸物质在机体生理病理活动中的作用，如囊泡中的miRNA 参与各类癌症的形成与发展[49-50]。囊泡中核酸的含量较低，因此，开发高效的核酸提取方法可推进相关方面的研究进展。沉淀法和离心柱法作为囊泡核酸提取的方法，既有相似性又有相异性，均是基于苯酚/氯仿的方法通过萃取使水相和酚相分离。由于核酸物质易溶于水的特性而存在于水相中，沉淀法是在萃取基础上通过乙醇沉淀回收核酸物质，离心柱则是通过固相萃取的方法完成核酸物质提取后的纯化步骤[51]。

目前，随着高通量检测技术发展，测序成为囊泡核酸物质检测常用的途径，具有良好的检测深度和覆盖范围，有助于囊泡新生物标志物的发现。长期的测序发展中，二代测序技术的出现对囊泡核酸物质的检测起到了很强的推动性，在测序市场中占有主导地位[52]。

4 生物囊泡在兽医领域中的应用

科学技术进步策动人类对生物囊泡的认识和研究不断加深，不仅使其在医学化工应用中崭露头角，也带动了其在兽医学领域的研究与应用[53-55]。研究发现，大多数动物乳液中存在囊泡，其内部含有具有免疫调节功能的miRNA。囊泡可随着乳液进入幼畜的消化道被机体消化吸收，进而调节幼畜消化系统和免疫系统的发育。不仅如此，乳液中的囊泡可作为药物载体，将亲水、亲脂性和化学类药物包裹并递送至特定部位发挥作用，这一发现大幅度提高了药物的利用率[56]。此外，囊泡对细胞间信息传递也具有促进作用。Regev-Rudzki等[57]通过试验表明，转基因疟原虫红细胞分泌的生物囊泡可以促进耐药基因的传递。Hugel 等[58]发现，某些虫源性细胞外囊泡能够转移毒力因子，可增强寄生虫的寄生能力，最终导致机体致病。陈晓琳等[59]研究指出，灌喂10 μL牛乳外泌体（1 g/L）对DSS诱导结肠炎的小鼠影响有限，可能受到了灌喂剂量较低的影响。这些信息有望给抗寄生虫药物新靶标研究带来新的启示。当前，生物囊泡在兽医学中的相关研究日益细节化，尤其是囊泡表面一些重要的膜蛋白对营养物质摄取具有促进作用，提示其若作为候选抗原可对疫苗研究发挥一定作用，对药物靶标研制也具有新的启发[60]。生物囊泡广泛存在机体的各种体液中，因而有望成为标志物质，在动物疾病诊断预防及疫苗研发等方面发挥重要作用。

5 结论

本文就生物囊泡的类型、分离与纯化技术、常用的鉴定技术及其在兽医领域的应用等4个方面总结了近年来生物囊泡的相关内容，指出生物囊泡作为可传递生物分子信息、参与机体生理病理活动的小泡体，涉及细胞生物学、免疫学、临床诊断等领域，在兽医领域也有所应用与研究。综上所述，生物囊泡的分离、纯化与鉴定标准化还存在诸多挑战，在兽医学领域中亦需进一步探索，以促进囊泡在兽医学及生物学领域应用的进一步发展。