石榴皮瓤提取物对成年小鼠体重增长及血浆免疫相关指标的影响

刘佳佳,韩 涛

(1.新疆畜牧科学院畜牧研究所,乌鲁木齐 830011;2.新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐 830011)

0 引 言

【研究意义】石榴营养价值丰富,包括维生素、蛋白质、脂肪以及多种微量元素,且石榴皮瓤提取物含有大量的多酚类化合物。鞣花酸(Ellagic acid)是一种分布在石榴皮瓤中的多酚类化合物,其生物学功能体现在机体抗氧化和抗炎症作用[1]。【前人研究进展】研究表明[2],多酚类化合物可以改善动物健康。Amor Antonio J等[3]研究显示,鞣花酸具有显著的抗氧化作用,能够减缓机体衰老。Hassan Fawzia A等[4]研究表明,石榴皮瓤提取物具有抗氧化和免疫调节的作用,可以提高机体免疫功能,有利于动物健康,且石榴皮瓤提取物是很有前景的天然抗氧化剂的来源。【本研究切入点】石榴皮瓤提取物与饲料中抗生素类添加剂相比没有副作用,且一定程度上能够提高动物生长性能和增强免疫力[5]。尚需研究石榴皮瓤提取物对小鼠体重、血浆抗氧化和促炎因子水平的影响。【拟解决的关键问题】以成年小鼠为研究对象,灌喂石榴皮瓤提取物,研究石榴皮瓤提取物对小鼠体重增长及氧化应激相关指标的影响,为研究鞣花酸调控机体抗氧化和抗炎的机制及生物学作用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验选择平均日龄50 d、体重相近(37.31±5.57)g、健康良好的SPF级雄性昆明小鼠30只,购自新疆医科大学。

在第21 d,所有试验小鼠断尾采血,将血样收集于肝素钠抗凝管内,室温静置10 min后3 500 r/min离心15 min,吸取上清,-20℃冷冻保存。同一个重复组3只小鼠的样品合为1个样品,即每个组最终5个样品,用于后续指标的测定。

1.2 方 法

1.2.1 石榴皮瓤中鞣花酸提取

在市场上购买新疆和田皮亚曼新鲜石榴,石榴去除籽实后剩余的皮瓤晾干后超微粉碎,用于提取鞣花酸。鞣花酸提取参考陈鹏等[6]方法。

1.2.2 试验设计

将试验小鼠,随机分为2组,分别为对照组和试验组,每组5个重复,每个重复3只,共15只。在相同基础日粮条件下试验组小鼠灌喂1.5 g/(d·只)石榴皮瓤粗提物[即鞣花酸的灌喂量为40.74 mg/(d·只)],将1.5 g提取物溶解于2 mL无菌蒸馏水中,分别在每天10:00和18:00分两次灌喂,每次灌喂1 mL,对照组每次灌喂等体积的无菌蒸馏水,进行为期21 d的灌喂试验。每周测定1次小鼠的平均采食量,试验结束当天小鼠晨饲前空腹称量体重,尾部采集小鼠血样并制取血浆,-20℃冷冻保存,待测。表1

表1 日粮组成及营养水平(以风干物质计,%)

1.2.3 测定鞣花酸含量

鞣花酸测定的色谱分析条件:色谱柱为C18(Welch Ultimate AQ-C18,4.6×250 mm,5 μm);流动相的配制:分别量取甲醇∶水∶冰乙酸按50∶49.85∶0.15(V/V/V)的比例混合,用0.45 μm滤膜抽滤,超声脱气30 min;检测波长:254 nm,柱温:35℃;进样量:20 μL。鞣花酸的平均含量为(27.16±5.26) mg/g(风干重)。

1.2.4 测定指标

常规指标:总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)和尿素氮(BUN);抗氧化相关指标:超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽氧化物酶(GSH-PX)、抑制羟自由基能力、抗超氧阴离子活力、总抗氧化能力(T-AOC)、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA);炎症因子相关指标:肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-17(IL-17A)和白细胞介素-10(IL-10)。所有指标检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,方法参考试剂盒提供的方法。

1.3 数据处理

在Excel中先将数据预处理,再使用SPSS19.0软件进行独立样本T检验,试验数据均以平均数±标准差(Mean±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 石榴皮瓤中鞣花酸含量的测定

研究表明,石榴皮瓤中提取的鞣花酸平均含量为(27.16±5.26) mg/g(风干重),自然风干基础上鞣花酸的有效含量为2.72%。

2.2 石榴皮瓤提取物对小鼠体重增长影响

研究表明,灌喂石榴皮瓤提取物对小鼠日均采食量和初始重均无显著影响(P>0.05)。能够显著提高试验组小鼠末重、总增重及平均日增重,分别比对照组提高了8.21%(P<0.05)、47.56%(P<0.05)和48.39%(P<0.05)。表2

表2 灌喂石榴皮瓤提取物下小鼠体重增长变化(n=15)

2.3 石榴皮瓤提取物对小鼠血浆常规指标影响

研究表明,灌喂石榴皮瓤提取物对小鼠血浆中总蛋白、白蛋白、球蛋白以及尿素氮均无显著影响(P>0.05),但能提高血浆中总蛋白、白蛋白和球蛋白含量,能够降低血浆中尿素氮的含量,比对照组低了33.48%(P>0.05)。表3

表3 灌喂石榴皮瓤提取物下小鼠血浆常规指标变化(n=15)

2.4 石榴皮瓤提取物对小鼠血浆抗氧化水平影响

研究表明,灌喂石榴皮瓤提取物能够显著提高试验组小鼠血浆SOD、CAT和T-AOC的水平,分别比对照组提高了24.44%(P<0.05)、54.82%(P<0.05)和27.69%(P<0.05),对GSH-PX活力无显著性影响(P>0.05);极显著提高了试验组小鼠血浆中抑制羟自由基能力和抗超氧阴离子活力,分别比对照组提高了36.01%(P<0.01)和43.21%(P<0.01);显著降低了试验组小鼠血浆MDA的浓度,比对照组降低了25.82%(P<0.05);能够提高血浆中NO的水平,但差异不显著(P>0.05)。表4

表4 灌喂石榴皮瓤提取物下小鼠血浆抗氧化水平变化(n=15)

2.5 对血浆炎症因子水平影响

研究表明,石榴皮瓤提取物能够显著降低试验组小鼠血浆中TNF-α和IL-17A的水平,分别比对照组降低了17.16%(P<0.05)和30.34%(P<0.05);对IL-10的水平无显著性影响(P>0.05)。表5

表5 石榴皮瓤提取物下小鼠血浆炎症相关指标水平变化(n=15)

3 讨 论

3.1鞣花酸是一种天然多酚类化合物,广泛存在于各种坚果、软果等植物组织(如草莓、覆盆子、黑莓、石榴、葡萄、核桃)中[7]。鞣花酸通常与葡萄糖等缩合成糖苷,进而参与鞣花单宁酚类化合物的形成,进入动物体内后先水解形成鞣花酸,大部分被肠道微生物代谢为尿石素[8]。鞣花酸具有广泛的生物学作用,包括抗氧化、抗肿瘤、抗突变及抗炎等[9]。补喂鞣花酸能够促进动物生长发育,与鞣花酸能够改善机体消化机能、促进肠道健康有关[10-11]。赵铭伟等[12]研究显示,仔猪基础日粮中添加鞣花酸(500 g/d),能够显著促进仔猪的体重增长。陈晖等[13]研究显示,灌喂石榴汁使SD大鼠体重和日增重比对照组提高了8.88%和36.32%(P<0.05)。试验中,给小鼠灌喂石榴皮瓤提取物,能够显著提高试验组小鼠末重、总增重及平均日增重,与赵铭伟等[12]和陈晖等[13]研究结果一致,鞣花酸对促进机体生长发育方面具有一定作用。体重的增加是因为日粮中蛋白质沉积率提高,还是改变了生长发育相关基因表达量及激素的水平所致,有待于进一步研究。

3.2血浆白蛋白作为营养物质的载体,可维持机体渗透压[14];血浆球蛋白由浆细胞分泌,具有增强机体免疫力、防止病毒和细菌入侵等作用[15]。周本宏等[16]研究发现,石榴皮鞣质对阿霉素肾病大鼠的肾脏具有保护作用,能够显著改善血浆TP以及ALB水平。在试验中,给小鼠灌喂石榴皮瓤提取物,血浆中TP、ALB以及GLB水平都呈升高趋势,说明鞣花酸在一定程度上参与机体蛋白质代谢,改善机体血浆中总TP、ALB以及GLB水平,维持机体健康[16]。BUN浓度的高低可直接反映机体蛋白质代谢和氨基酸的平衡状况[17]。日粮中粗蛋白质含量充足,氨基酸种类和比例均衡时,机体蛋白质、氨基酸的利用率提高,BUN含量就会降低[18]。试验中,灌喂石榴皮瓤提取物的小鼠血浆中BUN呈下降趋势。石榴皮瓤提取物的灌喂能够促进机体蛋白质的代谢,平衡氨基酸的水平[19-20]。

3.3氧化应激是机体内产生的自由基与抗氧化防御系统失衡的一种生物学现象[21]。MDA是脂质过氧化的产物,其含量可反映细胞氧化应激水平或器官脂质过氧化的程度[15]。Qiu等[22]通过测量膀胱癌T24细胞内的ROS水平、MDA水平和SOD活性来验证鞣花酸和尿石素A的抗氧化活性,发现鞣花酸和尿石素A均可降低H2O2诱导的膀胱癌T24细胞中的ROS和MDA水平,并增加了SOD的活性,尿石素A与其前体鞣花酸均可缓解T24细胞的氧化应激。骆静方等[23]研究发现,给糖尿病小鼠补喂鞣花酸后,其血浆中SOD活性升高、MDA含量显著降低。陈敏纯等[24]研究鞣花酸对缺血性脑卒中大鼠的保护作用结果显示,给予小鼠鞣花酸药物处理后,MAD含量显著降低并且能够显著增加SOD的活性。试验中,灌喂石榴皮瓤提取物极显著提高了试验组小鼠血浆中抑制羟自由基能力和抗超氧阴离子活性,显著提高了试验组小鼠血浆中SOD活性、CAT以及T-AOC的水平,显著降低了试验组小鼠血浆MDA的浓度,鞣花酸可以增强小鼠清除自由基以及机体抗氧化的能力。鞣花酸的生物学作用主要依赖肠道微生物代谢产生的尿石素[25]。尿石素是由鞣花酸失去一个内酯环,并逐步脱羟基而生成的[26],其保留了一定的抗氧化能力。鞣花酸及其衍生物的抗氧化效率与酚羟基数目有关[27],鞣花酸打开一个内酯环脱去羧基生成尿石素D,尿石素D通过脱去1,2或3个羟基分别生成尿石素C,尿石素A或尿石素B[28]。在氧化自由基吸收能力(ORAC)抗氧化指数试验中与抗坏血酸相比,尿石素A是尿石素类中抗氧化能力最强大的代谢产物[29]。线粒体自噬可通过调控线粒体的分裂与融合以清除功能受损的线粒体并抑制ROS的过量积累,对预防氧化损伤具有重要作用[30]。研究表明,短期的尿石素A处理可能会诱导线粒体自噬,维持线粒体呼吸功能,而长期尿石素A处理有助于促进线粒体生物合成[31]。试验中小鼠清除自由基以及机体抗氧化能力的提升,一方面可能与鞣花酸及其代谢产生的尿石素具有降低MDA含量、降低ROS、RNS水平以及提高SOD、CAT、GSH活性有关,另一方面鞣花酸及其代谢产生的尿石素激活了参与自噬启动的关键酶AMP激活的蛋白激酶 α(AMPK α)以及张力蛋白同源物诱导的蛋白激酶1(PINK-1)[32],诱导线粒体自噬,并清除功能受损的线粒体以及抑制ROS的过量积累,从而提高了小鼠的抗氧化能力。

3.4多酚类化合物抗炎的生物学作用在人和动物模型实验中已被证实[7]。缪福俊等[32]研究发现,在核桃多酚中,在机体内通过抑制TNF-α以及IL-6等相关炎症因子的表达,减轻炎症反应。肖玉欣等[7]研究表明,鞣花酸抗炎活性主要表现为降低MCP-1、IL-6、IL-1β和TNF-α水平以及降低细胞迁移与粘附。鞣花酸抗炎活性主要表现为降低机体相关炎症因子的表达以及降低细胞迁移与黏附。Marin等[33]验证了鞣花酸在急性和慢性溃疡性结肠炎中的抗炎作用,鞣花酸能够降低IL-6和TNF-α的分泌。鞣花酸的生物学作用的发挥主要依靠肠道微生物将其代谢为尿石素[7]。在动物模型中,尿石素对于小鼠足水肿具有急性抗炎作用[34],并且尿石素可减少小鼠全身性炎症因子的产生(IL-6,TNF-α)[35]。IL-17是T细胞诱导的炎症反应早期启动因子,可以促进T细胞的激活和刺激细胞黏附分子,从而导致炎症的产生[36]。试验中,给小鼠灌喂石榴皮瓤提取物能够显著降低试验组小鼠血浆中TNF-α和IL-17A的水平,鞣花酸具有促进炎症因子分泌,抑制炎症因子表达的作用。可能与鞣花酸能够降低调节炎症反应关键分子的表达与含量有关,如TNF-α和IL-10,同时可能由于鞣花酸能够减弱成纤维细胞和内皮细胞的迁移以及单核细胞的黏附[37],从而抑制炎症反应,具体的调控路径和潜在的机制有待于进一步的研究表明。

4 结 论

给小鼠灌喂石榴皮瓤提取物可显著提高小鼠末重、总增重及平均日增重,促进小鼠生长发育;可极显著提高试验组小鼠血浆中抑制羟自由基能力和抗超氧阴离子活力;显著提高SOD、CAT以及T-AOC水平;显著降低MDA、TNF-α和IL-17A的水平。鞣花酸具有提高小鼠抗氧化以及缓解炎症的作用。