微小RNA-19a-3p对充血性心力衰竭模型大鼠心肌纤维化的影响及机制研究

刘 鹏,陈 阵

(武汉市中医医院心内科,湖北 武汉 430010)

充血性心力衰竭(Congestive heart failure,CHF) 指由于心室充盈或泵血功能障碍,导致心排血量无法满足机体代谢需要的综合征[1]。尽管CHF在诊断方面取得了进展,但其发病率和病死率仍然较高[2]。因此,探究CHF发生的分子机制对于CHF的治疗具有重要意义。许多微小RNA(microRNA,miR)被认为是诊断和治疗疾病的生物标志物和可能的治疗靶点[3]。miR-19a-3p位于人14号染色体,是长度约82 bp的非编码RNA[4]。研究[5]报道,上调miR-19a-3p水平可减轻心力衰竭中心肌细胞的肥大。另外,心肌纤维化在心力衰竭的发生、发展中发挥重要的作用[6]。目前,关于miR-19a-3p对CHF大鼠心肌纤维化的影响鲜有报道。因此,本研究通过构建CHF大鼠模型,探讨miR-19a-3p对CHF大鼠心肌纤维化的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只,体重180～200 g,购自广州锐格生物公司,生产许可证号:SCXK(粤)2021-0059。所有大鼠喂养于有温控、12 h明暗循环的环境中,自由饮水和进食。本研究动物实验符合3R原则,获得本院动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 miR-19a-3p激动剂(miR-19a-3p agomir,货号:20221205)及其阴性对照(NC agomir,货号:20221208)均购自广州锐博生物技术有限公司;腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂Compound C(批号:S7840)购自MCE公司;兔源一抗沉默信息调节因子1(SIRT1,货号:K000319P)、AMPK(货号: K106707P)、 三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH,货号:K206390M)及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(货号:SE134)、Masson三色染色试剂盒(货号:G1340)、2×SYBR Green PCR Mastermix(货号:SR1110)购自北京索莱宝科技有限公司;Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ,货号:ab34710)、Collagen Ⅲ(货号:ab7778)、转化生长因子-β(TGF-β,货号:ab31013)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α,货号:ab191838)、p-AMPK(货号:ab23875)购自美国Abcam公司;Prime ScriptTMRT Master Mix(货号:RR036A-1)购自日本TAKARA公司。

1.3 实验方法

1.3.1 CHF模型构建:麻醉大鼠后,在剑突下腹部正中线处分离腹主动脉,将7号注射器针头放于腹主动脉上,与腹主动脉平行,用0号手术线结扎腹主动脉和针头后将针头抽出,构建腹主动脉狭窄来诱发CHF[7]。建模4周后,行心脏彩超检测左心室射血分数(LVEF),若LVEF≤45%则表示造模成功[8]。

1.3.2 实验分组与处理:将大鼠分为对照组(NC组)、模型组(Model组)、NC agomir组、miR-19a-3p agomir组、miR-19a-3p agomir+Compound C组,每组12只。其中,NC组仅暴露腹主动脉不结扎,其他组均构建CHF模型(各组大鼠均造模成功);NC agomir组和miR-19a-3p agomir组分别通过尾静脉注射NC agomir和miR-19a-3p agomir;miR-19a-3p agomir+Compound C组除需尾静脉注射miR-19a-3p agomir外,还需注射250 μg/kg Compound C[9],每3天注射1次,持续15 d。15 d后检测大鼠血流动力学参数及心脏功能指标。然后处死大鼠,收集心肌组织,一部分固定于4%多聚甲醛中,另一部分冻存于-80 ℃冰箱中(每部分包含6只大鼠心肌组织)。

1.3.3 血流动力学参数检测:末次给药禁食12 h后,用2.5%异氟醚麻醉大鼠,通过右颈动脉穿过主动脉瓣插入微压计尖端导管,采用Power Lab数据采集系统观察并记录左心室收缩压(LVSP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)。

1.3.4 心脏功能指标检测:麻醉大鼠后,使用超声波和21 MHz探头在左心室长轴乳头肌水平处检测心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、室间隔厚度(IVS)和LVEF。

1.3.5 Masson染色检测心肌纤维化:用100 mg/kg戊巴比妥钠处死大鼠,磷酸盐缓冲液(PBS)灌注后取出心脏,采用Masson三色染色试剂盒检测厚5 μm的心肌组织切片的纤维化程度,用光学显微镜观察大鼠心肌纤维化情况。

1.3.6 Western blot检测蛋白表达:用RIPA裂解缓冲液裂解并提取心肌组织总蛋白,BCA法进行蛋白质定量后,取50 μg蛋白质电泳,转移到PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭1 h,在4 ℃下加入一抗Collagen Ⅰ(1∶2000稀释)、Collagen Ⅲ(1∶1000稀释)、TGF-β(1∶1000稀释)、AMPK(1∶1000稀释)、SIRT1(1∶2000稀释)、PGC-1α(1∶2000稀释)、p-AMPK(1∶2000稀释)、GAPDH(1∶2000稀释),孵育过夜后与二抗(1∶2000稀释)共同孵育1 h。加入ECL试剂后观察蛋白显色情况,通过Image J软件分析蛋白灰度值。

1.3.7 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-19a-3p表达:用TRIzol试剂提取心肌组织匀浆总RNA,采用Prime ScriptTMRT Master Mix将RNA反转录为cDNA,用2×SYBR Green PCR Mastermix进行PCR反应。miR-19a-3p正向引物序列为5’-CAATCCTCTCAGGCTCAGTCC-3’,反向引物序列为5’-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC-3’;以U6为内参,其正向引物序列为5’-CTCGCTTCGGCACCACA-3’,反向引物序列为5’-AACGGTTCACGGATTTGCGT-3’。miR-19a-3p的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

2 结 果

2.1 各组大鼠血流动力学参数比较 见表1。与NC组比较,Model组大鼠LVSP、+dp/dtmax降低(均P<0.05)。与Model组和NC agomir组比较,miR-19a-3p agomir组大鼠LVSP、+dp/dtmax升高(均P<0.05)。与miR-19a-3p agomir组比较,miR-19a-3p agomir+Compound C组大鼠LVSP、+dp/dtmax降低(均P<0.05)。

表1 各组大鼠血流动力学参数比较

2.2 各组大鼠心脏功能指标比较 见表2。与NC组比较,Model组大鼠LVESD、LVEDD、IVS升高,LVEF降低(均P<0.05)。与Model组和NC agomir组比较,miR-19a-3p agomir组大鼠LVESD、LVEDD、IVS降低,LVEF升高(均P<0.05)。与miR-19a-3p agomir组比较,miR-19a-3p agomir+Compound C组大鼠LVESD、LVEDD、IVS升高,LVEF降低(均P<0.05)。

表2 各组大鼠心脏功能指标比较

2.3 各组大鼠心肌Masson染色结果 见图1。经Masson染色后,胶原纤维呈蓝色,心肌细胞呈红色。与NC组比较,Model组心肌纤维化程度加重。与Model组和NC agomir组比较,miR-19a-3p agomir组心肌纤维化程度减轻。与miR-19a-3p agomir组比较,miR-19a-3p agomir+Compound C组心肌纤维化程度加重。

注:A为NC组;B为Model组;C为NC agomir组;D为miR-19a-3p agomir组;E为miR-19a-3p agomir+Compound C组

2.4 各组大鼠心肌组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β蛋白表达比较 见表3。与NC组比较,Model组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β蛋白表达升高(均P<0.05)。与Model组、NC agomir组比较,miR-19a-3p agomir组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β蛋白表达降低(均P<0.05)。与miR-19a-3p agomir组比较,miR-19a-3p agomir+Compound C组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β蛋白表达升高(均P<0.05)。

表3 各组大鼠心肌组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β蛋白表达比较

2.5 各组大鼠心肌组织miR-19a-3p和AMPK/SIRT1/PGC-1α通路相关蛋白表达比较 见表4。与NC组相比,Model组miR-19a-3p表达水平及p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达降低(均P<0.05)。与Model组和NC agomir组比较,miR-19a-3p agomir组miR-19a-3p表达水平以及p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达升高(均P<0.05)。与miR-19a-3p agomir组比较,miR-19a-3p agomir+Compound C组miR-19a-3p表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05),p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达降低(均P<0.05)。

表4 各组大鼠心肌组织miR-19a-3p和AMPK/SIRT1/PGC-1α通路相关蛋白表达比较

3 讨 论

CHF是由结构性或功能性心脏病引起的复杂综合征,可使心室射血或充血功能障碍[10-11]。出现CHF前会发生左心室重构,其特征是心肌纤维化形成,包括Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β增加[12-14]。心肌纤维化是CHF进展的主要驱动因素,过度纤维化会引发大面积的梗死瘢痕,导致心脏血流动力学受损及心脏功能障碍[15]。本研究通过构建CHF大鼠模型,经Masson染色后发现,与NC组比较,Model组大鼠心肌纤维化程度加重,促纤维相关指标Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β蛋白表达显著升高,血流动力学参数LVSP、+dp/dtmax显著降低,心脏功能相关指标LVESD、LVEDD、IVS显著升高,LVEF显著降低,提示CHF大鼠存在心肌纤维化、血流动力学受损以及心脏功能障碍。

miRNA是天然存在的小非编码RNA。有研究[16-17]证明,miRNA在心力衰竭中失调。研究[18]发现,miR-19a-3p在心力衰竭患者的血浆中低表达,过表达miR-19a-3p可降低TGF-β1信号诱导的人心脏成纤维细胞纤维化。而关于miR-19a-3p对CHF大鼠心肌纤维化影响的相关研究较少。本研究结果显示,miR-19a-3p在CHF大鼠心肌组织中低表达,过表达miR-19a-3p后CHF大鼠心肌纤维化程度减轻,Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β蛋白表达显著降低,LVEDD、IVS显著降低,LVEF显著升高,表明过表达miR-19a-3p可改善CHF大鼠心肌纤维化,减轻血流动力学受损及心脏功能障碍。提示miR-19a-3p可能成为治疗CHF的潜在有效靶点。

众所周知,AMPK和SIRT1在肌纤维类型转换和肌肉能量代谢中发挥重要作用[19-20]。AMPK是维持细胞能量稳态的能量传感器,激活的AMPK会增加细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水平,进而激活SIRT1并最终催化PGC-1α脱乙酰化[21]。研究[22]发现,白藜芦醇通过激活AMPK/SIRT1/PGC-1α通路促进肌纤维类型从快肌纤维类型转换为慢肌纤维。丹七片可激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路,改善缺血性心脏病大鼠的心脏功能,防止心肌损伤[23-24]。本研究结果显示,与NC组比较,Model组p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达显著降低,提示AMPK/SIRT1/PGC-1α通路可能参与了CHF大鼠心肌纤维化过程。与Model组、NC agomir组比较,miR-19a-3p agomir组p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达显著升高,推测过表达miR-19a-3p可能通过激活AMPK/SIRT1/PGC-1α通路抑制CHF大鼠心肌纤维化。为了验证该推测,本研究在过表达miR-19a-3p的基础上采用AMPK抑制剂Compound C干预CHF大鼠,结果发现Compound C可减弱过表达miR-19a-3p对CHF大鼠心肌纤维化、血流动力学受损及心脏功能障碍的改善作用。

综上所述,过表达miR-19a-3p可能通过激活AMPK/SIRT1/PGC-1α通路抑制CHF大鼠心肌纤维化,改善血流动力学受损以及心脏功能障碍。miR-19a-3p可能成为治疗CHF的潜在靶点。然而,过表达miR-19a-3p抑制CHF大鼠心肌纤维化机制较复杂,miR-19a-3p具体通过AMPK/SIRT1/PGC-1α通路下游的哪些蛋白行使功能尚不明确,有待进一步分析研究。