植物乳杆菌强化发酵茖葱泡菜条件优化研究

肖雄峻,胡兰馨,刘丽娟,王浩杰,杜悦,毛祥*

(1.四川轻化工大学 生物工程学院,四川 宜宾 644000;2.泸州国之荣耀酒业有限公司,四川 泸州 646000)

茖葱(AlliumvictorialisL.)别名山葱、隔葱、鹿耳葱、角葱,广泛分布于我国黑龙江、吉林、辽宁、河北、山西、内蒙古、陕西、甘肃(东部)、湖北、河南和浙江(天目山)、四川(北部)等地区[1]。近年来,对茖葱的药理研究发现,茖葱挥发性提取物中分离得到的含硫化合物及黄酮化合物等是其重要的活性成分,在防治心血管疾病、降血脂、降血糖、抗肿瘤及抗炎等方面有着潜在的疗效,极具开发价值[2-3]。目前,国内民众对茖葱的认识大多还停留在药用价值方面,对于我国东北地区民众来讲,茖葱早已成为人见人爱的健康野菜。其在欧美、日、韩等国也备受推崇[4],特别是日、韩两国还长期从我国东北地区进口茖葱,仅日本一国年消费量在800吨以上且还有扩大的趋势,在韩国也只有高星级的酒店才会提供[5],由此可以看出人们对茖葱的喜爱。但新鲜茖葱采摘期短(一般在2个月左右),不耐储存,极易腐烂,这给茖葱的跨距离、跨季节销售带来了严峻挑战。因此,对茖葱进行精深加工对解决这一现实矛盾具有重要意义。

近年来,国内外学者对茖葱做了大量研究,一是对茖葱的化学成分组成及药理学进行研究,如Nishimura首次从茖葱挥发油中提取了甲基烯丙基硫醚(methyl allyl sulfide)、二甲基二硫(dimethyl disulfide)、二烯丙基硫醚(diallyl sulfide)、甲基丙基二硫醚(methyl propyl disulfide)等14种物质[6]。从茖葱中提取的烯丙基三硫化合物(allyl trisulfides)和阿焦烯(ajoene)有很好的抗凝剂作用,而且二硫化物和三硫化物对降低胆固醇、降血脂和预防癌症有较强的作用[7]。在含硫化合物中起抗凝剂作用的主要成分是乙烯基二半胱亚砜(vinyldithiins)[8]。Li等还从茖葱鳞茎中分离出两种类黄酮(flavonoid)和一种类固醇皂苷(steroidal saponins)[9]。胡兴鹏等[10]通过一维、二维核磁、高分辨质谱等手段鉴定了8种黄酮类物质,其中两种为新型结构的黄酮类物质。黄翠菊[11]对茖葱中分离的黄酮粗提物、皂苷粗提物进行组合实验,验证了二者对小白鼠的免疫系统具有良好调节效果。李雅萌[12]的研究结果显示茖葱 70%乙醇提取物可改善烟雾所致小鼠肺功能损伤,抑制炎性因子水平,提高抗氧化能力,对香烟烟雾诱导的抗慢性阻塞性肺疾病具有一定的抗炎及抗氧化损伤作用,且以高剂量(0.32 g/kg)作用更明显,表明茖葱中含有丰富的风味物质,极具营养价值和药用价值。二是茖葱种植、栽培及育种等方面的研究,关于茖葱有性繁殖与无性繁殖的初步研究、栽培技术[13]、物种分类[14]等方面的研究已经比较成熟,对茖葱的推广、消费起到了极大的促进作用,但是针对后续茖葱产品开发相关研究却未得到同步发展,极大地束缚了茖葱消费市场空间的发展。加之当前对茖葱进行深加工的研究报道较少,因此本研究在借鉴四川泡菜制作工艺的基础上,以感官评分为标准,针对茖葱接种乳酸菌进行强化发酵,以期开发出一款具有良好风味和较好品质的茖葱泡菜,为茖葱产品的开发及精深加工提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜茖葱:购自四川绵阳;商品茖葱泡菜(500 g/袋):丹东荣正食品有限公司;食盐、花椒、八角、桂皮、香叶、蔗糖、高度白酒:均购于当地超市。其他试剂:均为分析纯,成都市科隆化学品有限公司。

菌种:植物乳杆菌hd01(Lactobacillusplantarum),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC No.:M2015184,下文简称“乳酸菌”。

MRS固体培养基:蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温80 1.0 mL、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL,自然pH,116 ℃,湿热灭菌20 min。

1.2 主要仪器与设备

A390型紫外可见分光光度计 翱艺仪器(上海)有限公司;UPT-I-20T优普超纯水机 四川优普超纯科技有限公司;XHF-DY高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司;ME204E/02电子天平、FE28 pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;ZWY-211C恒温培养振荡器、ZHJH-C1118C超净工作台 上海智城分析仪器制造有限公司;BSP-400生化培养箱、BG2-140电热鼓风干燥箱、BXM-75立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化与计数

菌种活化:将保藏的植物乳杆菌菌种接种于MRS固体培养基上,37 ℃培养48 h,重复操作活化两代,转接斜面备用。

菌悬液制备:使用10 mL无菌生理盐水将活化后的乳酸菌从试管斜面洗下,转移至250 mL无菌三角瓶(含3粒玻璃珠)中,混匀后制成菌悬液,于600 nm波长处,用生理盐水将其浊度稀释至1 OD。

菌落计数:采用浇注平板法对上述菌悬液进行计数,浊度为1 OD的乳酸菌菌悬液中含有1.18×108CFU/mL的活细胞。

1.3.2 茖葱泡菜制作工艺

茖葱泡菜的制作参照敖军等报道的四川泡菜制作工艺进行[15],见图1。

图1 茖葱泡菜制作工艺流程图Fig.1 Production process flow chart of Allium victorialis pickles

1.3.3 单因素试验优化茖葱泡菜制作工艺

于250 mL烧杯中,添加50 g茖葱和150 mL泡菜水,分别对食盐添加量(1%、2%、3%、4%、5%,食盐质量与泡菜水体积比)、增脆剂氯化钙添加量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%,氯化钙质量与泡菜水体积比)、乳酸菌接种量(3%、4%、5%、6%、7%,1.18×108CFU/mL的乳酸菌液体积与泡菜水体积比)、蔗糖添加量(1%、2%、3%、4%、5%,蔗糖质量与泡菜水体积比)、发酵温度(22,27,32,37,42 ℃)进行优化,发酵时间为6 d,以模糊数学综合感官评分为主评价茖葱泡菜的品质,确定最佳制作工艺条件,同时监测其总酸和游离酸含量。在优化各单因素试验时,其他因素均为最佳条件,每组试验做3个生物学重复。

1.3.4 Box-Behnken设计优化茖葱泡菜制作工艺

从食盐添加量、乳酸菌接种量、增脆剂添加量、蔗糖添加量、发酵温度中选出对茖葱泡菜品质影响最大的3个因素及相应水平,用Design Expert软件进行三因素三水平Box-Behnken响应面优化设计,以模糊数学综合感官评分为主要评价指标,确定最佳制作工艺条件组合,同时监测其总酸和游离酸含量,Box-Behnken三因素三水平设计表见表1。

表1 Box-Behnken 因素水平设计表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.5 茖葱泡菜的模糊数学综合感官评价

1.3.5.1 感官评价标准表

邀请10名人员对茖葱泡菜的色泽、滋味、组织状态和香气进行感官评价及评分,要求评定人员在评定前12 h内不吸烟、不饮酒、不食辛辣等刺激性食物,评定一个样品后以清水漱口,间隔10 min再评定下一个样品,最后填好评分表并签名[16]。将各评定人员的评定结果收集起来进行分析。

1.3.5.2 感官评价因素权重的确定

感官评价因素权重表示各评分因素对茖葱泡菜感官影响的相对重要性。评价因素占比之和为1,表示为X=(x1,x2,x3,…xn)。本次茖葱泡菜试验由10名评定人员对商品茖葱泡菜的色泽、滋味、组织状态、香气4个质量因素在感官评价(见表2)中的权重进行评分,总分为10分,认为最重要的质量因素占的权重最大,评分越高。统计各指标的得分在总分中的占比,计算得出各因素的权重X=(0.21,0.3,0.29,0.20)。

表2 茖葱泡菜感官评价标准表Table 2 Sensory evaluation criteria for Allium victorialis pickles

1.3.5.3 模糊矩阵的建立

以色泽、滋味、组织状态、香气4项指标组成因素集U=(色泽,滋味,组织状态,香气)=(u1,u2,u3,u4)。模糊评价以好、一般、差对各因素进行评价,3个指标的评语集记为V=(好,一般,差)=(v1,v2,v3)T,在感官评分时,v1=8～10,v2=4～7,v3=0～3,样品的模糊矩阵R=U×V。

1.3.5.4 模糊数学综合评分矩阵方程

1.3.6 游离酸及总酸测定

茖葱泡菜游离酸的测定采用pH计法进行测定,总酸的测定参照国标GB 12456-2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》的方法进行[17]。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 食盐添加量对发酵茖葱泡菜品质的影响

食盐在泡菜制作过程中具有防腐和增味的作用[18],是影响泡菜发酵过程的重要环境因素。由图2中A可知,在食盐添加量为1～3 g/dL时,茖葱泡菜的综合感官评分随着食盐添加量的增加而增加,说明在低浓度盐含量条件下,盐对茖葱泡菜的风味具有提升作用,可能是因为低盐发酵茖葱泡菜中杂菌生长代谢抑制不明显,影响了茖葱泡菜的风味(滋味和气味);然而随着食盐添加量的增加,茖葱泡菜的综合感官评分反而降低,一方面是因为高浓度的盐对茖葱泡菜生产过程中微生物无差别地抑制,影响了茖葱泡菜风味的形成;另一方面是因为食盐是泡菜的重要呈味物质,使茖葱泡菜的咸味增加,影响了茖葱泡菜的综合感官评分。由图2中B可知,茖葱泡菜中总酸随着食盐添加量的增加而呈下降趋势,pH则随食盐添加量的增加而升高,说明食盐添加量对茖葱泡菜发酵过程中总酸及pH的影响较大,泡菜制作过程中的主要有机酸为乳酸、乙酸等[19],这些有机酸在泡菜中电离出H+,使茖葱泡菜的pH值下降,当pH值在3.7～4.9之间时,茖葱泡菜即可显示出明显的酸感,若pH值低于3.0,则酸味过强,难以适口。简而言之,在茖葱泡菜发酵过程中,适当的食盐添加量能赋予泡菜风味,抑制杂菌生长,增强泡菜的风味。茖葱泡菜制作时食盐添加量为3 g/dL时,其综合感官评分最高,为7.156分。

图2 不同食盐添加量对茖葱泡菜品质的影响Fig.2 Effect of different salt addition amount on the quality of Allium victorialis pickles注:A为食盐添加量对茖葱泡菜综合感官评分的影响,B为食盐添加量对茖葱泡菜总酸、pH值的影响;同一折线不同小写字母表示组间显著性差异(P<0.05)。

2.1.2 乳酸菌接种量对发酵茖葱泡菜品质的影响

大量研究表明泡菜发酵过程中的优势菌群是乳酸菌,其迅速繁殖,并利用泡菜原料产生有机酸(乳酸、醋酸、柠檬酸)、氨基酸及多种芳香风味物质[20],因此我们探究了乳酸菌对茖葱泡菜品质的影响。由图3中A可知,乳酸菌接种量在3%～5%时,茖葱泡菜的综合感官评分呈上升趋势,之后随着乳酸菌接种量的升高,茖葱泡菜的综合感官评分呈下降趋势,原因可能是泡菜中接种乳酸菌数量增多,对应乳酸菌菌群达到稳定期的时间缩短,代谢产物积累的时间也相应缩短,致使高于6%乳酸菌接种量的茖葱泡菜中总酸含量偏高,pH值降低(见图3中B),酸感变强,影响产品的感官评分。乳酸菌接种量为5%时,综合感官评分最高,为7.578,故选择最佳乳酸菌接种量为5%。

图3 不同乳酸菌接种量对茖葱泡菜品质的影响Fig.3 Effects of different inoculation amount of lactic acid bacteria on the quality of Allium victorialis pickles 注:A为乳酸菌接种量对茖葱泡菜综合感官评分的影响,B为乳酸菌接种量对茖葱泡菜总酸、pH值的影响;同一折线不同小写字母表示组间显著性差异(P<0.05)。

2.1.3 增脆剂氯化钙添加量对发酵茖葱泡菜品质的影响

茖葱是一种叶类蔬菜,由于其在发酵过程中容易变软易碎,影响茖葱泡菜的美观,而氯化钙能保持果蔬加工制品的脆度和硬度[21],因此研究了添加0.01～0.05 g/dL氯化钙对发酵茖葱泡菜品质的影响。由图4可知,氯化钙添加量为0.01～0.03 g/dL时,总酸呈上升趋势,pH逐渐下降,但均未达到显著水平(P>0.05),同时,综合感官评分也得到提升;说明氯化钙对茖葱泡菜质构品质方面起到了一定作用。添加量为0.03～0.05 g/dL时,总酸呈下降趋势,pH逐渐上升,综合感官评分开始下降。可能的原因是食品添加剂氯化钙的添加量不宜过大,否则产品会产生苦涩味,影响口感[22],当氯化钙添加量为0.03 g/dL时,总酸和pH最适宜,综合感官评分最高,为7.911,按FAO/WHO规定,氯化钙在酸黄瓜中单用或与其他凝固剂合用量不应超过0.25 g/kg(以Ca2+计),约为氯化钙0.69 g/kg,茖葱泡菜中增脆剂添加量符合该规定的使用剂量,故选择氯化钙的最佳添加量为0.03 g/dL。

图4 不同增脆剂氯化钙添加量对茖葱泡菜品质的影响Fig.4 Effects of different embrittling agent calcium chloride addition amount on the quality of Allium victorialis pickles注:A为增脆剂氯化钙添加量对茖葱泡菜综合感官评分的影响,B为增脆剂氯化钙添加量对茖葱泡菜总酸、pH值的影响;同一折线不同小写字母表示组间显著性差异(P<0.05)。

2.1.4 蔗糖添加量对发酵茖葱泡菜品质的影响

糖类物质不仅会影响最终产品的滋味,还可以作为乳酸菌通过代谢途径产生有机酸、醇类和酯类等重要风味物质的底物[23],也是许多传统泡菜的制作原料。由图5可知,蔗糖添加量为1～2 g/dL时,对茖葱泡菜的综合感官评分影响不明显,但添加量继续增加,茖葱泡菜呈现出明显甜味,影响食品的综合感官评分。但蔗糖添加量由1 g/dL增加至2 g/dL时,茖葱泡菜中总酸及pH值的变化均达到显著水平(P<0.05),在茖葱泡菜发酵过程中添加蔗糖,能为泡菜微生物发酵提供更充足的碳源,促进乳酸菌、酵母菌等产酸微生物代谢酸类物质,形成酸味,进而影响泡菜的感官。当蔗糖添加量超过2 g/dL后,蔗糖在茖葱中的甜味变得明显,反而会影响茖葱泡菜的综合感官评分。蔗糖添加量达到5 g/dL时,茖葱泡菜中的总酸含量下降,左旦[22]也报道5 g/dL的蔗糖会抑制泡菜发酵过程中总酸的增加,原因可能是茖葱泡菜发酵体系中蔗糖、食盐及无机盐等对微生物渗透作用的叠加,影响微生物生长,减缓了茖葱泡菜的发酵进程。综上所述,选择最佳蔗糖添加量为2 g/dL时综合感官评分最高,为7.873。

图5 不同蔗糖添加量对茖葱泡菜品质的影响Fig.5 Effects of different sucrose addition amount on the quality of Allium victorialis pickles注:A为蔗糖添加量对茖葱泡菜综合感官评分的影响,B为蔗糖添加量对茖葱泡菜总酸、pH值的影响;同一折线不同小写字母表示组间显著性差异(P<0.05)。

2.1.5 发酵温度对发酵茖葱泡菜品质的影响

大多数乳酸菌的最适生长温度为37 ℃左右,因此研究了发酵温度对茖葱泡菜品质的影响,由图6可知,随着发酵温度的升高,茖葱泡菜的综合感官评分呈下降趋势,说明提高发酵温度能缩短乳酸菌的发酵周期,加速“亚硝峰”出现,但发酵茖葱泡菜的质量也有所下降[24]。相较于27 ℃,采用22 ℃发酵时,会有乳酸菌生长缓慢的现象出现,导致总酸偏低,且发酵周期会延长,而 27 ℃发酵时,泡菜的综合感官评分虽有所下降,但总酸和pH都达到一个理想水平。当发酵温度在22～32 ℃之间,其pH值变化不显著(P>0.05),发酵温度在27 ℃时,总酸含量最高(0.51 g/100 g),在22,32 ℃条件下发酵的茖葱泡菜总酸含量变化未达到显著水平;当温度进一步升高,茖葱泡菜中总酸含量显著下降,pH值显著上升,在42 ℃条件下,茖葱泡菜的综合感官评分下降显著,同时泡菜液颜色变深,风味也产生了变化,有异味,可能是乳酸菌生长受到了抑制,导致丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)等杂菌生长[25]。综合分析,选择27 ℃为茖葱泡菜的最佳发酵温度。

图6 不同发酵温度对茖葱泡菜品质的影响Fig.6 Effects of different fermentation temperatures on the quality of Allium victorialis pickles注:A为不同发酵温度对茖葱泡菜综合感官评分的影响,B为不同发酵温度对茖葱泡菜总酸、pH值的影响;同一折线不同小写字母表示组间显著性差异(P<0.05)。

2.2 Box-Behnken响应面条件优化分析

2.2.1 三因素三水平的确定

综合考虑单因素试验结果,最终选择食盐添加量(A)、蔗糖添加量(B)及发酵温度(C)进行响应面试验设计,试验结果见表3,该模型方差分析结果见表4。

表3 Box-Behnken试验设计及响应值Table 3 Box-Behnken test design and response values

表4 Box-Behnken感官评分方差分析结果Table 4 Results of variance analysis of sensory score byBox-Behnken

2.2.2 基于综合感官评分结果的响应面回归模型的建立与分析

由表4可知,该回归模型的P=0.040 1(<0.05),达到显著水平,相关系数R2=0.837 8,说明模型拟合度较好,信噪比=5.150 3(>4),表明该模型受外部因素的影响较小;C.V.=4.11%,表明该模型的离散程度较小,失拟项不显著。综上所述,表明该模型可信度高,可用于茖葱泡菜发酵试验结果的模拟预测。

以综合感官评分为因变量(Y3),对食盐添加量(A)、蔗糖添加量(B)、发酵温度(C)为自变量拟合得到非线性回归方程:Y3=7.79-0.039A+0.014B-0.079C-0.003AB+0.086AC-0.0035BC-0.59A2-0.52B2-0.20C2。根据F值大小判断各因素对茖葱泡菜综合感官评分的影响大小为发酵温度>食盐添加量>蔗糖添加量,在二次项中,A2、B2均达到极显著水平(P<0.01)。而各因素对综合感官评分的交互影响均未达到显著水平。

结合等高线和响应面(见图7)可知,发酵温度对综合感官评分的影响最大。当发酵温度恒定时,pH受蔗糖添加量和发酵温度的协同作用影响较小,曲面坡度较缓;当蔗糖添加量或食盐添加量恒定时,综合感官评分较大程度上受到食盐添加量和发酵温度、蔗糖添加量和发酵温度的协同作用影响,对应的响应面较陡峭。

图7 不同发酵条件对茖葱泡菜感官评分影响的响应面及等高线Fig.7 Response surface diagrams and contour lines of effects of different fermentation conditions on the sensory scores of Allium victorialis pickles

综上,响应面模型分析优化得到的最佳发酵工艺条件为食盐添加量2.95 g/dL、蔗糖添加量3.01 g/dL、发酵温度25.93 ℃,结合试验的可操作性,将其修正为食盐添加量3 g/dL、蔗糖添加量3 g/dL、发酵温度26 ℃。

2.3 验证Box-Behnken优化试验结果

为验证回归模型预测值的有效性,按照响应面试验条件接种5%乳酸菌(1.18×108CFU/mL),添加0.03 g/dL的增脆剂氯化钙、3 g/dL食盐、3 g/dL蔗糖于26 ℃条件下发酵6 d进行试验验证(n=3),在该条件下,茖葱泡菜的综合感官评分为(7.851±0.124)分,总酸含量为0.39 g/dL,pH值为3.77,与Box-Behnken试验模型的预测值基本保持一致,表明模型预测结果可信度较高。

3 总结

通过对成品茖葱泡菜进行感官品评,确定了茖葱泡菜的综合感官评分中色泽、滋味、组织状态、香气的占比为21∶30∶29∶20,并建立了茖葱泡菜的模糊数学综合感官评价体系;以综合感官评价体系为自制强化发酵茖葱泡菜的评价指标,对食盐添加量、蔗糖添加量、增脆剂氯化钙添加量、乳酸菌接种量、发酵温度等条件进行单因素试验,结果表明,茖葱泡菜最佳强化发酵条件为食盐添加量3 g/dL、乳酸菌接种量5%、增脆剂氯化钙添加量0.03 g/dL、蔗糖添加量3 g/dL、27 ℃发酵6 d;在单因素条件优化基础上,对自制强化发酵茖葱泡菜进行Box-Behnken响应面条件优化,结果表明在食盐添加量3 g/dL、蔗糖添加量3 g/dL、发酵温度26 ℃条件下发酵的茖葱泡菜综合感官评分最高,为(7.851±0.124)分,总酸含量为0.39 g/dL,pH为3.77,此时茖葱的口感最佳,酸甜适宜,脆嫩多汁,同时伴有茖葱独特的葱香和蒜香。