响应面法优化草鱼鱼丸复合抗冻剂的研究

韩冰,姜晓涵,徐英楠,韩雪,遇世友,夏昆源,张根生

(哈尔滨商业大学 食品工程学院,哈尔滨 150028)

草鱼是我国重要的养殖淡水鱼,年产量居我国“四大家鱼”之首,2021年其总产量高达575.51万吨,占淡水鱼养殖产量的21.80%[1]。我国淡水鱼消费多采用“鲜活销售”和“家庭烹饪”相结合的方式,淡水鱼的深加工比例较低,而鱼糜制品具有高蛋白质、低脂肪和低胆固醇等优点[2],所以鱼糜制品的开发成为近年来研究的热点[3],而鱼丸、鱼豆腐、鱼糕和鱼肠等鱼糜制品已成为当前深受欢迎的速冻调理食品。速冻鱼丸在生产、运输和储存过程中由于温度波动的影响,冰晶逐渐增多,品质快速下降[4-5],因此提升鱼丸冻融稳定性受到广泛关注。

目前主要从两方面进行速冻食品冻融稳定性的提高,一方面是控制冰晶的形成,另一方面是抑制肌原纤维蛋白氧化变性。其中,抑制肌原纤维蛋白氧化变性主要利用抗冻剂来完成[6]。传统的商业抗冻剂常采用4%的蔗糖与4%的山梨糖醇混合后使用,抗冻效果较好,但蔗糖与目前人们追求的“低甜和低热”的消费趋势不符,不适于糖尿病患者食用;多聚磷酸盐的摄入存在加重高血压或慢性肾病的风险[7-8]。因此,对抗冻效果好且符合消费趋势的抗冻剂的研究尤为重要。

实验表明,抗冻剂对反复冻融期间的鱼丸的品质具有显著影响[9]。鉴于此,本研究首先以草鱼鱼糜为原料,添加不同含量的海藻糖、VE和蔗糖脂肪酸酯,研究其对鱼丸凝胶特性和感官评价的影响,反映抗冻剂对鱼丸品质的影响情况,最终通过响应面实验确定最佳配方。本研究为鱼丸复合抗冻剂的开发与发展提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草鱼:哈尔滨前进大市场;食盐、味精、白砂糖、蒜粉、白胡椒粉、鸡蛋、白酒、马铃薯淀粉、大豆分离蛋白、大豆油、海藻糖、VE、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇等:市售;硫代巴比妥酸、氧化镁:天津市富宇精细化工有限公司;丙二醛、1,1,3,3-四乙氧基丙烷:德州润昕实验仪器有限公司;盐酸、三氯乙酸、甲基红、溴甲酚绿、乙二胺四乙酸:苏州瑞测检测技术服务有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-4型数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司;LA8080全自动凯氏定氮仪 日本株式会社日立高新技术科学那柯事业所;BR4I离心机 上海安亭科学仪器厂;722型可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;ALC-2100.2型电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司;CS-800型色差仪 杭州彩谱科技有限公司;C21-SK805型电磁炉 美的生活电器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 草鱼鱼糜的制备

原料鱼→前处理→采肉→漂洗→精滤→脱水→擂溃→成型→凝胶→熟化→冷却→成品。

1.3.2 持水率的测定

采用Campbell等[10]的方法测定鱼丸凝胶的持水率并稍作修改。准确称取质量为m(3.00 g)的鱼丸,平摊在两层滤纸上包裹好,置于50 mL离心管中,在10 000 r/min下离心15 min,离心后取出称重,质量记为m1,每组样品测定3次,取平均值,通过下式计算持水率:

(1)

式中:m为离心前样品质量(g);m1为离心后样品质量(g)。

1.3.3 TBARS值的测定

参照GB 5009.181-2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》中的分光光度法并稍作修改。首先称取鱼丸5.00 g,加入50 mL三氯乙酸混合液,在50 ℃下匀浆30 min后冷却至室温,过滤弃沉淀,然后在上清液中加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液,混匀,90 ℃反应30 min后冷却,最后在532 nm处测定样品溶液的吸光度值,丙二醛含量由1,1,3,3-四乙氧基丙烷标准曲线确定,吸光度值(y)对TBARS值(x)的标准曲线为y=0.802 9x+0.053 5,TBARS值的计算公式为:

(2)

1.3.4 挥发性盐基氮含量的测定

参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的凯氏定氮法。

1.3.5 低场核磁共振的测定

参考Jiao等[11]的方法并稍加修改。首先将鱼丸在室温下恒温30 min,然后切取约2 g样品放入核磁管中,最后采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脉冲序列进行自旋-自旋弛豫时间T2、T2峰比例的测定。

1.3.6 感官品质的评定

感官评价由受过专业培训的感官评定小组(10人)根据表1对鱼丸的感官品质进行综合评定。将鱼丸切成1 cm左右的薄片,通过品尝来评价鱼丸反复冻融后的风味、色泽、形态和质地,计算感官评价得分。

表1 感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria

1.3.7 单因素实验设计

1.3.7.1 海藻糖添加量对鱼丸品质的影响

以鱼糜质量为基准,分别添加淀粉15%、蛋清10%、大豆油5%、白砂糖5%、白酒4%、蒜粉1%、味精0.3%、白胡椒粉0.2%、水12%、食盐2.5%和大豆分离蛋白4%,考察海藻糖添加量(0%、2%、4%、6%、8%)对鱼丸持水率、TBARS值、挥发性盐基氮、水分迁移和感官评分的影响。

1.3.7.2 VE添加量对鱼丸品质的影响

以鱼糜质量为基准,分别添加淀粉15%、蛋清10%、大豆油5%、白砂糖5%、白酒4%、蒜粉1%、味精0.3%、白胡椒粉0.2%、水12%、食盐2.5%和大豆分离蛋白4%,考察VE添加量(0%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%)对鱼丸持水率、TBARS值、挥发性盐基氮、水分迁移和感官评分的影响。

1.3.7.3 蔗糖脂肪酸酯添加量对鱼丸品质的影响

以鱼糜质量为基准,分别添加淀粉15%、蛋清10%、大豆油5%、白砂糖5%、白酒4%、蒜粉1%、味精0.3%、白胡椒粉0.2%、水12%、食盐2.5%和大豆分离蛋白4%,考察蔗糖脂肪酸酯添加量(0%、0.06%、0.09%、0.12%、0.15%)对鱼丸持水率、TBARS值、挥发性盐基氮、水分迁移和感官评分的影响。

1.4 复合抗冻剂的响应面实验设计

根据单因素实验的结果,选取海藻糖添加量(A)、VE添加量(B)和蔗糖脂肪酸酯添加量(C)3个因素的3个水平,以持水率(Y1)和不易流动水占比(Y2)作为复合抗冻剂最优配方的响应值进一步设计响应面实验,复合抗冻剂响应面实验因素水平见表2。

表2 复合抗冻剂响应面实验因素水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment of compound cryoprotectant

1.5 数据统计与分析

每组实验重复3次,最后的结果用平均值±标准差表示,数据采用SPSS 24.0进行方差和显著性分析,P<0.05为差异显著;采用Origin 2021软件进行绘图,采用Design-Expert V8.0.6统计软件进行实验设计与数据分析。

2 结果与分析

在冷冻的条件下,细菌的氧化代谢及酶活性会受到一定程度的抑制[12]。但是随着冻藏时间的延长,鱼肉在内源酶和细菌代谢酶等物质的作用下,蛋白结构会发生变化,导致鱼肉的持水率下降、品质变差和机械性损伤等问题[13-16]。因此,通过对鱼丸进行持水率、TBARS值、TVB-N值、水分分布和感官评价的检测来反映不同物质对冻融循环鱼丸品质的影响。

2.1 海藻糖添加量对冻融循环鱼丸品质及水分迁移的影响

2.1.1 海藻糖添加量对冻融循环鱼丸品质的影响

海藻糖对细胞和生物体的活力具有保护作用,被称为“生命之糖”[17]。近年来,海藻糖作为天然抗冻保护剂逐渐应用于冷冻食品品质改善的研究。海藻糖添加量对鱼丸的持水率、TBARS值和挥发性盐基氮的影响见图1。

图1 海藻糖添加量对鱼丸持水率、TBARS值、挥发性盐基氮的影响Fig.1 Effect of trehalose addition amount on the water holding rate, TBARS value and volatile basic nitrogen of fish balls注:不同字母表示差异显著(P<0.05),下图同。

由图1可知,鱼丸的持水率随着冻融次数的增加呈现持续降低的趋势,TBARS值和挥发性盐基氮值则呈现持续升高的趋势。反复冻融3次后,添加4%海藻糖鱼丸的持水率为86.27%,明显优于海藻糖添加量0%、2%、6%、8%的实验组(P<0.05)。与此同时,TBARS值和挥发性盐基氮值分别升至0.304 mg/kg和15.096 mg/100 g,明显低于0%、2%、6%、8%海藻糖实验组(P<0.05)。这可能是由于海藻糖的添加使鱼丸组织的电解质含量降低,通过改变蛋白分子中的结合水状态,抑制蛋白的变性,进而减少了冰晶的生成[18]。海藻糖添加量过高可能会促使鱼丸的细胞膜及细胞器破裂,蛋白质劣变加速,血红素铁的释放加快[19],从而持水率降低速率加快,脂肪氧化速度和微生物的生长速度加快,品质逐渐下降,这与余璐涵等[20]的研究结果一致。

海藻糖添加量对鱼丸感官评分的影响见图2。

图2 海藻糖添加量对鱼丸3次冻融后感官评分的影响Fig.2 Effect of trehalose addition amount on the sensory score of fish balls after repeated freeze-thaw for three times

由图2可知,添加4%海藻糖的鱼丸经过3次冻融后,品质明显高于海藻糖添加量为0%、2%、6%、8%的实验组,这可能是由于添加适量的海藻糖可以抑制冰晶的生成和脂肪氧化,提升了冻融后鱼丸的感官品质。

2.1.2 海藻糖添加量对冻融循环鱼丸水分迁移的影响

不易流动水与肉类持水率密切相关[21],是本实验中最主要的研究对象,海藻糖添加量对鱼丸水分迁移的影响见图3。

图3 海藻糖添加量对3次冻融鱼丸水分迁移的影响Fig.3 Effect of trehalose addition amount on the water migration of fish balls after repeated freeze-thaw for three times

由图3可知,添加不同含量海藻糖的鱼丸中有4个峰,分别对应的横向弛豫时间为T21、T22、T23和T24,合并为3种状态的水,分别为结合水(0.1～10 ms)、不易流动水(10～100 ms)和自由水(100～1 000 ms)。PT21和PT22代表结合水,PT23代表不易流动水,PT24代表自由水。由图3可知,反复冻融3次后,4%海藻糖鱼丸组的PT23和PT24明显优于其他4组。当海藻糖添加量为4%时,不易流动水含量较高,自由水含量较低,此时凝胶效果较好,增加了鱼丸冻融的稳定性。这可能是因为海藻糖可以有效地保护蛋白质分子的天然结构,降低蛋白质的冷冻变性,增加耐冻性,抑制冰晶的形成,减少水分的流失[22],因此可以对鱼糜样品起到良好的保水作用。

2.2 VE添加量对冻融循环鱼丸品质及水分迁移的影响

2.2.1 VE添加量对冻融循环鱼丸品质的影响

VE添加量对鱼丸持水率、TBARS值和挥发性盐基氮的影响见图4。

图4 VE添加量对鱼丸持水率、TBARS值和挥发性盐基氮的影响Fig.4 Effect of VE addition amount on the water holding rate, TBARS value and volatile basic nitrogen of fish balls

由图4可知,随着冻融次数的增加,鱼丸的持水率持续下降,TBARS值和挥发性盐基氮值持续升高。反复冻融3次后,添加0.1% VE的鱼丸持水率为83.20%,TBARS值和挥发性盐基氮值分别升至0.303 mg/kg和12.588 mg/100 g,明显优于添加0%、0.05%、0.15%、0.2% VE的实验组(P<0.05)。这可能是因为VE对持水率的提升作用与其对细胞膜的修复作用有关,因此,当添加适量的VE时,反复冻融后鱼丸的持水率降低速率减慢。同时,适量的VE对脂肪氧化和微生物的生长均有一定的抑制作用,随着冻融次数的增加,抑制效果逐渐明显。这可能是因为VE阻碍脂肪氧化发生链式反应[23]的同时也延缓了蛋白质的分解,从而抑制了TVB-N值的上升。因此通过本实验可知,添加0.1% VE对抑制鱼丸的脂肪氧化效果显著,这与Tang等[24]的研究结果一致。

VE添加量对鱼丸感官评分的影响见图5。

图5 VE添加量对鱼丸感官评分的影响Fig.5 Effect of VE addition amount onthe sensory score of fish balls

由图5可知,添加0.1% VE的鱼丸经过3次冻融后,品质明显高于VE添加量为0%、0.05%、0.15%、0.2%的实验组,这可能是由于适量的VE会抑制脂肪氧化和微生物的生成,从而保证了鱼丸的感官品质。

2.2.2 VE添加量对冻融循环鱼丸水分迁移的影响

由图6可知,VE添加量不同的鱼丸中水分有4个峰,添加0.1% VE时不易流动水占比(PT23)高于其他4组,自由水占比(PT24)低于其他4组。由此结果可以看出,当VE添加量为0.1%时,不易流动水含量较高,自由水含量较低,凝胶效果较好,冻融后的鱼丸更加稳定。这可能是因为鱼丸中含有大量脂肪,VE作为抗氧化剂可以有效地抑制脂肪的氧化程度,抑制不易流动水和自由水的迁移。

图6 VE添加量对冻融3次鱼丸水分迁移的影响Fig.6 Effect of VE addition amount on the water migration of fish balls after repeated freeze-thaw for three times

2.3 蔗糖脂肪酸酯添加量对冻融循环鱼丸品质及水分迁移的影响

2.3.1 蔗糖脂肪酸酯添加量对冻融循环鱼丸品质的影响

蔗糖脂肪酸酯是一种乳化剂,鱼丸中含有大量的脂肪、蛋白质和水分等物质,蔗糖脂肪酸酯可以很好地将互不相溶的成分相互混合[25],从而提高鱼丸的稳定性。蔗糖脂肪酸酯添加量对鱼丸持水率、TBARS值和挥发性盐基氮的影响见图7。

图7 蔗糖脂肪酸酯添加量对鱼丸持水率、TBARS值和挥发性盐基氮的影响Fig.7 Effect of sucrose fatty acid ester addition amount on the water holding rate, TBARS value and volatile basic nitrogen of fish balls

由图7可知,随着冻融次数的增加,鱼丸的持水率呈现持续降低的趋势,TBARS值和挥发性盐基氮值持续升高。反复冻融3次后,添加0.09%蔗糖脂肪酸酯的鱼丸持水率为85.67%,TBARS值和挥发性盐基氮值分别升至0.313 mg/kg和14.170 mg/100 g,明显优于0%、0.06%、0.12%、0.15%蔗糖脂肪酸酯的实验组(P<0.05)。一方面,随着冻融次数的增加,肌原纤维蛋白结构遭到破坏,凝胶网络劣化,导致鱼丸的持水率持续下降[9]。另一方面,鱼丸在冻藏过程中,脂肪氧化加速了肌原纤维蛋白的变性,从而导致鱼丸的持水率下降[26]。而添加0.09%的蔗糖脂肪酸酯可以有效地延缓鱼丸的水分流失,使鱼丸中互不相溶的成分相互混合,形成乳化现象,致使鱼丸的脂肪和蛋白质更加稳定,不易被氧化。同时,也有研究表明,蔗糖脂肪酸酯对微生物有一定的抑制作用,因此适量的蔗糖脂肪酸酯会抑制微生物的生成[27],从而使TVB-N值上升缓慢。

蔗糖脂肪酸酯添加量对鱼丸感官评分的影响见图8。

图8 蔗糖脂肪酸酯添加量对鱼丸感官评分的影响Fig.8 Effect of sucrose fatty acid ester addition amount on the sensory score of fish balls

由图8可知,添加0.09%蔗糖脂肪酸酯的鱼丸经过3次冻融后,感官品质明显高于蔗糖脂肪酸酯添加量为0%、0.06%、0.12%、0.15%的实验组。这可能是由于蔗糖脂肪酸酯起到了乳化作用,将互不相溶的成分相互混合,进而抑制脂肪氧化。

2.3.2 蔗糖脂肪酸酯添加量对冻融循环鱼丸水分迁移的影响

蔗糖脂肪酸酯添加量对冻融3次鱼丸水分迁移的影响见图9。

图9 蔗糖脂肪酸酯添加量对冻融3次鱼丸水分迁移的影响Fig.9 Effect of sucrose fatty acid ester addition amount on the water migration of fish balls after repeated freeze-thaw for three times

由图9可知,反复冻融3次后,添加0.09%蔗糖脂肪酸酯时鱼丸的不易流动水占比(PT23)高于其他4组,自由水占比(PT24)低于其他4组。这说明3次冻融导致鱼丸内部细小的冰晶重结晶,不易流动水逐渐向自由水转化,水的流动性增强,较多的自由水扩散到冻藏环境中,从而导致持水率逐渐下降。由此结果可以看出,当蔗糖脂肪酸酯添加量为0.09%时,不易流动水含量较高,凝胶效果较好,鱼丸冻融后更加稳定。

2.4 抗冻剂响应面实验结果

在单因素实验的基础上,以海藻糖添加量(A)、VE添加量(B)和蔗糖脂肪酸酯添加量(C)为影响因子,以鱼丸的持水率(Y1)和不易流动水占比(Y2)两个指标作为响应值,进行响应面分析实验,Box-Behnken 实验设计见表3。

表3 Box-Behnken 实验设计Table 3 Box-Behnken experiment design

通过Design Expert软件对所得数据进行回归分析,分别获得了持水率(Y1)和不易流动水占比(Y2)与自变量海藻糖添加量(A)、VE添加量(B)和蔗糖脂肪酸酯添加量(C)的二次多项回归方程:

Y1=87.128+0.182 5A+0.285B+0.16C-0.3AB-0.295AC-0.52BC-2.764A2-0.629B2-1.359C2。

Y2=88.574+0.706 25A-0.457 5B+0.213 75C-0.13AB-0.057 5AC-0.92BC-1.755 75A2-1.538 25B2-0.939 75C2。

进一步对该回归模型进行方差分析,持水率的回归模型及方差分析见表4,不易流动水占比的回归模型及方差分析见表5。

表4 Y1的回归模型及方差分析Table 4 Regression model and variance analysis of Y1

表5 Y2的回归模型及方差分析Table 5 Regression model and variance analysis of Y2

由表4可知,Y1模型的P值<0.000 1,说明该模型达到极显著水平,模型是稳定的。失拟项的F值为5.749,P=0.062 1>0.05,说明失拟项差异不显著,能充分反映情况。确定系数R2=0.986,校正决定系数RAdj2=0.968,说明96.8%的响应值变化能用该模型来解释,模型的拟合程度良好,实验误差小。FA=2.716、FB=6.626和FC=2.088,即各因素对持水率的影响程度大小顺序为VE添加量>海藻糖添加量>蔗糖脂肪酸酯添加量。海藻糖添加量与VE添加量的交互作用显著(P<0.05),VE添加量与蔗糖脂肪酸酯添加量的交互作用极显著(P<0.01)。

由表5可知,Y2模型极显著(P<0.01),失拟项不显著(P>0.05),模型选择正确。确定系数R2=0.970 0,校正决定系数RAdj2=0.931 3,说明响应值变化的93.13%能用该模型来解释,模型拟合程度较好。各因素对不易流动水占比的影响程度大小顺序为海藻糖添加量>VE添加量>蔗糖脂肪酸酯添加量,且VE添加量与蔗糖脂肪酸酯添加量之间具有极显著的交互作用(P<0.01)。

2.5 响应面分析交互作用

海藻糖添加量、VE添加量、蔗糖脂肪酸酯添加量之间的交互作用对鱼丸持水率和不易流动水占比的响应面曲线图见图10和图11。

图10 各因素交互作用对持水率的影响Fig.10 Effect of interaction of various factors on the water holding rate

图11 各因素交互作用对不易流动水占比的影响Fig.11 Effect of interaction of various factors on the proportion of immobilized water

由图10可知,响应曲面的坡度较陡,说明海藻糖添加量(A)与VE添加量(B)的交互作用、海藻糖添加量(A)与蔗糖脂肪酸酯添加量(C)的交互作用和VE添加量(B)与蔗糖脂肪酸酯添加量(C)的交互作用对持水率的影响较敏感。交互作用显著性从大到小依次是BC>AB>AC。

由图11可知,响应曲面的坡度较陡,说明海藻糖添加量(A)与VE添加量(B)的交互作用、海藻糖添加量(A)与蔗糖脂肪酸酯添加量(C)的交互作用和VE添加量(B)与蔗糖脂肪酸酯添加量(C)的交互作用对不易流动水占比的影响较敏感。交互作用显著性从大到小依次是BC>AB>AC。

2.6 验证实验

对二次多项回归模型进行最优求解,选择海藻糖添加量3.01%、VE添加量0.1%、蔗糖脂肪酸酯添加量0.09%为最优方案。预测持水率为87.090 7%和不易流动水占比为88.680 4%。为检验实验的可靠性,采用上述优化参数进行验证实验,实际实验结果为平均持水率87.54%和平均不易流动水占比88.16%。持水率和不易流动水占比的验证结果与理论值无显著性差异(P>0.05)。因此,二者皆说明回归模型准确,模型能够较好地预测持水率和不易流动水占比的变化情况。

3 结论

根据单因素实验和响应面优化的实验结果,以冻融循环后鱼丸的持水率、TBARS、TVB-N、水分迁移和感官评价作为指标,确定复合抗冻剂的最佳工艺为海藻糖添加量3.01%、VE添加量0.1%和蔗糖脂肪酸酯添加量0.09%。对最佳工艺参数进行验证实验,得到的鱼丸持水率和不易流动水占比与模型理论值接近,证明其工艺可行。本研究采用海藻糖、VE和蔗糖脂肪酸酯作为复合抗冻剂,在保留鱼丸感官的前提下,为探究制作鱼丸的抗冻剂提供了参考依据。