刺梨果渣酵素复合发酵工艺优化

陈秋慧,魏建敏,穆先,卢红梅,杨双全,陈莉*

(1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵阳 550025;2.贵州大学 酿酒与食品工程学院,贵阳 550025;3.贵州大学 化学与化工学院,贵阳 550025)

刺梨(RosaroxburghiiTratt.)又叫送春归、茨梨,是蔷薇科落叶灌木植物缫丝花的果实,适宜生长在海拔500～1 500 m的高山丘陵地带,如中国西南地区的贵州、云南、四川等省份,其中贵州刺梨产量居全国之首[1-2]。截至2021年,作为刺梨种植大省的贵州省,其种植面积已达到210万亩,鲜果产量达28.91万吨。随着国内外果蔬汁饮料逐渐向营养型方向转变,刺梨因富含营养成为营养型饮料的研究热点之一[3]。

刺梨果渣是刺梨鲜果压榨刺梨原汁所留下的副产物,刺梨果渣含有丰富的营养物质[4],具有抗氧化、降血糖等功效[5-7],有很高的价值,但不易储存,造成大量浪费且污染环境[8]。酵素因富含益生菌、脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶和多酚、黄酮、氨基酸、有机酸等生物活性成分而在食品和健康领域受到广泛关注[9-10]。大量研究表明,酵素具有抗氧化、抗肿瘤、解酒护肝、调节肠道菌群、减肥、抑菌等功效[11-16]。相关研究表明,酵素经发酵后不仅能大量保留发酵基质原有的营养物质,而且能促进多酚、黄酮等次级产物的形成,具有促进新陈代谢、抗氧化、抗疲劳等生理功能[17]。因此,本试验以酶解后的刺梨果渣为发酵物料,采取先酵母菌发酵后植物乳杆菌发酵的方式,在单因素试验的基础上进行优化试验,探究不同因素对刺梨果渣酵素中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及活菌数的影响,以期得到刺梨果渣酵素的最佳发酵工艺条件,为刺梨果渣的开发利用提供数据支撑。

1 材料和方法

1.1 原料

刺梨干果渣:贵州省盘州市某刺梨加工企业提供。

1.2 试剂

活性干酵母(BV818、CECA、SY、RW):安琪酵母股份有限公司;植物乳杆菌1.191:广东省微生物菌种保藏中心;SOD试剂盒:南京建成生物工程研究所;果浆酶、氯化钠、次甲基蓝、氯化钾、无水氯化钙(均为分析纯):成都金山化学试剂有限公司;碳酸氢钠、葡萄糖、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、MRS肉汤培养基、营养琼脂、蔗糖:天津永大化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器与设备

FA2004N精密电子天平 上海菁海仪器有限公司;HH-B数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司;ZD-2A 自动电位滴定仪 上海大普仪器有限公司:SPX-250B生化培养箱 上海琅玕实验设备有限公司;YXQ-LS-5DS11压力蒸汽灭菌锅、SN-CJ-IF无菌操作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;TG16-WS 台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;722S可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;Smart生物显微镜 重庆奥特光学仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 刺梨果渣酵素制备工艺

工艺流程图见图1。

图1 工艺流程图Fig.1 Process flow diagram

酵母菌的活化:取一定量的安琪酵母(以发酵物料的质量计),加入适量的蒸馏水,于37 ℃的恒温水浴锅中活化30 min后待用。

植物乳杆菌的活化:取一管于EP管中甘油保藏的植物乳杆菌37 ℃活化后,接入100 mL灭菌后的MRS肉汤培养基中,于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后待用。

1.4.2 酵母菌发酵阶段单因素试验

采用单因素轮换法,分别考察酵母菌菌种(BV 818、CECA、SY、RW)、发酵时间(8,16,24,32,40 h)、发酵温度(21,23,25,27,29 ℃)、糖添加量(3%、4%、5%、6%、7%)、酵母菌接种量(0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%)对SOD活性和酵母菌活菌数的影响,确定各因素的最佳值。

1.4.3 酵母菌发酵阶段响应面试验

在单因素试验的基础上,以发酵时间、糖添加量、发酵温度、酵母菌接种量4个因素为研究因素,以SOD活性和酵母菌活菌数为评价指标,根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理,并采用Design Expert 8.0.6软件进行数据分析,确定刺梨果渣酵素的最优发酵条件。酵母菌发酵阶段响应面试验因素水平表见表1。

表1 酵母菌发酵阶段响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test in yeast fermentation stage

1.4.4 乳酸菌发酵阶段单因素试验

以SOD活性和乳酸菌活菌数为评价指标,在发酵温度37 ℃、乳酸菌接种量2%、发酵时间24 h、乳酸菌接种量2%的条件下,固定其他因素条件,确定发酵时间(8,16,24,32,40 h)、乳酸菌接种量(1%、1.5%、2%、2.5%、3%)、发酵温度(35,36,37,38,39 ℃)等因素的最佳值。

1.4.5 乳酸菌发酵阶段正交试验

在单因素试验的基础上,以发酵时间、乳酸菌接种量、发酵温度为因素,以SOD活性和乳酸菌活菌数为评价指标,设计L9(33)正交试验,每组试验平行测定3次,因素水平表见表2。

表2 乳酸菌发酵阶段正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test in lactic acid bacteria fermentation stage

1.4.6 SOD的测定

取1.0 g发酵物料,加入4 mL pH 6.8的磷酸缓冲液于研钵中研磨1～2 min后,转入离心管中,4 000 r/min离心10 min,取上清液参照SOD试剂盒进行测定。

1.4.7 酵母菌活菌数的测定

采用血球计数法进行测定[18]。

1.4.8 乳酸菌活菌数的测定

参照GB 4789.35-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》中的平板计数法进行测定。

1.4.9 数据处理及分析

每组试验进行3次平行。采用Design Expert 8.0.6进行响应面试验设计,SPSS 19.0、Excel 2010进行数据分析,Origin 2018进行作图。

2 结果与分析

2.1 酵母菌发酵阶段单因素试验

2.1.1 酵母菌菌种及发酵时间的确定

酵母菌种类及发酵时间对SOD活性和酵母菌活菌数的影响见图2。

图2 发酵时间对不同菌种发酵的SOD活性及酵母菌活菌数的影响Fig.2 Effect of fermentation time on SOD activity and viable number of yeast fermented with different strains注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下图同。

由图2可知,不同酵母菌菌种对SOD活性的影响很小,从整体来看,SOD活性与酵母菌活菌数成正比,均随时间的增加呈先升高后降低的趋势,这可能是因为随着时间的增加,可利用的碳源减少,不能正常给酵母菌提供营养物质,从而导致酵母菌活菌数减少。当以SOD活性作为评价指标时,菌种RW在发酵时间为24 h时达到最大值261.22 U/g,此时酵母菌活菌数为1.24×108CFU/g;当以酵母菌活菌数为评价指标时,菌种CECA在发酵时间为24 h时达到最大值1.30×108CFU/g,此时SOD活性为259.67 U/g。综合考虑,选择菌种CECA进行发酵,取发酵时间16～32 h进行后续研究。

首先，如今财务管理也进入了信息化时代，如果没有专业过硬的财务相关知识，中小学的财务管理水平就不会与时俱进，所以在对财务人员进行入职选择时，应考虑该财务人员是否持有相关的专业资格证书，是否具有财务工作经验，以保证将来学校财务人员的专业性和实践能力。

2.1.2 糖添加量的确定

糖添加量对SOD活性和酵母菌活菌数的影响见图3。

图3 糖添加量对SOD活性和酵母菌活菌数的影响Fig.3 Effect of sugar addition amount on SOD activity and viable number of yeast

由图3可知,随着糖添加量的增加,SOD活性和酵母菌活菌数呈先上升后下降的趋势,当糖添加量从3%上升到5%时,酵母菌活菌数随着可利用碳源的增加而增加,SOD活性随之增加,在糖添加量为5%时达到最大值,此时SOD活性为257.54 U/g,酵母菌活菌数为1.29×108CFU/g;当糖添加量从5%上升至7%时,发酵体系中糖量过高,形成高渗状态,抑制菌种的生长和代谢,产酶活力下降,SOD活性和酵母菌活菌数逐渐降低[19];同时,糖添加量过高会使pH值增加,不利于第二步发酵中植物乳杆菌的生长,因此选择4%～6%的糖添加量进行后续研究。

2.1.3 发酵温度的确定

发酵温度对SOD活性和酵母菌活菌数的影响见图4。

图4 发酵温度对SOD活性和酵母菌活菌数的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on SOD activity and viable number of yeast

由图4可知,随着发酵温度的增加,SOD活性和酵母菌活菌数均呈先升高后降低的趋势,在25 ℃时达到最大值,此时SOD活性为259.09 U/g,酵母菌活菌数为1.30×108CFU/g。温度过高或过低都不利于酵素的发酵,温度过低,酵母菌生长缓慢,发酵周期长;温度过高,会对机体的酶及代谢活动产生不利影响,使活菌数的增长速度减缓,因此选择23～27 ℃进行工艺优化。

2.1.4 酵母菌接种量的确定

酵母菌接种量对SOD活性和酵母菌活菌数的影响见图5。

由图5可知,SOD活性随着酵母菌接种量的增加先升高,在0.2%时达到最大值260.08 U/mL,之后随着酵母菌接种量的增加而降低,接种量在0.1%～0.2%范围内酵母菌活菌数随着接种量的增加而增加,在0.2%时达到最大值1.31×108CFU/g后趋于平稳,不再上升。初始接种量过低,菌种密度低,不能充分利用发酵体系中的碳源,使SOD活性不能达到最大值;若初始接种量过高,菌体密度过大,导致前期繁殖速度过快,产生的大量有机酸使SOD活性降低[19],综合考虑,选择0.15%～0.25%进行响应面优化。

2.2 酵母菌发酵阶段响应面试验

在单因素试验的基础上,选取发酵时间(A)、糖添加量(B)、发酵温度(C)、酵母菌接种量(D)4个因素,以SOD活性、酵母菌活菌数为响应值,通过Design Expert 8.6.0软件进行试验设计,试验设计及结果见表3。

以SOD活性、酵母菌活菌数为响应值,利用Design Expert 8.0.6软件对表3中的数据进行多元回归拟合,得到SOD活性(Y1)、酵母菌活菌数(Y2)的回归方程分别为:

Y1=259.45-3.44A-0.27B-15.83C+1.00D-7.21AB-27.41AC-4.91AD-2.75BC-4.00BD+18.40CD-32.82A2-16.54B2-27.85C2-27.29D2;

Y2=1.42+0.015A-0.021B-0.023C+0.074D+0.073AB+(5.000E-004)AC+0.065AD+(7.125E-003)BC+0.053BD+(8.125E-003)CD-0.19A2-0.19B2-0.13C2-0.086D2。

SOD活性、酵母菌活菌数方差分析及显著性结果见表4和表5。

表4 SOD活性方差分析及显著性结果Table 4 SOD activity variance analysis and significance results

表5 酵母菌活菌数方差分析及显著性结果Table 5 Variance analysis and significance results of viable number of yeast

由表4和表5可知,两个回归模型均极显著(P<0.000 1),说明该模型能很好地描述试验结果,得出的方程有意义。失拟项的P值分别为0.444 2,0.182 8,均大于0.05,差异不显著,说明该模型拟合度较好。相关系数分别为0.980 4,0.979 5,调整相关系数分别为0.960 8,0.958 9,说明试验误差较小,具有较高的参考价值,可以对SOD活性和酵母菌活菌数进行预测分析。

当以SOD活性为响应值时,一次项C极显著,A显著,B、D不显著;交互项AC、CD极显著,AB显著,AD、BC、BD不显著;二次项A2、B2、C2、D2均极显著。由F值可知,各因素对SOD活性的影响大小为C>A>D>B,即发酵温度>发酵时间>酵母菌接种量>糖添加量。当以酵母菌活菌数为响应值时,一次项D极显著,B、C显著,A不显著;交互项AB、AD、BD极显著,AC、BC、CD不显著,二次项A2、B2、C2、D2均极显著。由F值可知,各因素对酵母菌活菌数的影响大小为D>C>B>A,即酵母菌接种量>发酵温度>糖添加量>发酵时间。

各因素对响应值影响的响应面及等高线见图6和图7。

图6 各因素交互作用对SOD活性的影响Fig.6 Effects of interaction of various factors on SOD activity

图7 各因素交互作用对酵母菌活菌数的影响Fig.7 Effects of interaction of various factors on viable number of yeast

响应面图曲面坡度越陡峭,其对应的等高线越密集,形状呈椭圆形或马鞍形,说明两因素间交互作用影响越大[20]。由图6可知,因素A与因素C、因素C与因素D间的曲面最陡峭,因素A与因素B间的陡峭程度次之,且等高线均呈椭圆形,说明两两因素间交互作用较强,影响显著;因素A与因素D、因素B与因素C、因素B与因素D间响应面曲面较平缓,等高线近似圆形,表明各因素间交互作用较弱,影响不显著。由图7可知,因素A与因素B、因素A与因素D、因素B与因素D间所形成的坡面陡峭,等高线密集,呈椭圆形,说明两两因素间对酵母菌活菌数的影响较大,交互作用显著;因素A与因素C、因素B与因素C、因素C与因素D间的响应面曲面较平缓,等高线较稀疏,交互作用影响不显著。

2.3 响应面验证试验

利用软件Design Expert 8.6.0对两个模型联合求解,得到酵母菌发酵阶段最佳工艺条件为发酵时间24.3 h、糖添加量4.97%、发酵温度24.67 ℃、酵母菌接种量0.21%,在此条件下SOD活性预测值为260.30 U/g,酵母菌活菌数预测值为1.43×108CFU/g。考虑到试验操作问题,将最佳工艺条件修正为发酵时间24.5 h、糖添加量5%、发酵温度24.7 ℃、酵母菌接种量0.21%,在此条件下进行3次平行验证试验,得到SOD活性为(267.64±3.43) U/g,酵母菌活菌数为(1.41±0.04)×108CFU/g,试验值与预测值接近,表明该模型确定的工艺条件较可靠。

2.4 乳酸菌发酵阶段单因素试验

2.4.1 发酵时间的确定

发酵时间对SOD活性和乳酸菌活菌数的影响见图8。

图8 发酵时间对SOD活性和乳酸菌活菌数的影响Fig.8 Effect of fermentation time on SOD activity and viable number of lactic acid bacteria

由图8可知,发酵时间少于24 h时,SOD活性随着发酵时间的增加而上升,发酵时间为24 h时,SOD活性达到最大值271.99 U/g,此时乳酸菌活菌数为5.25×107CFU/g,继续进行发酵,随着发酵时间的延长,SOD活性逐渐降低;乳酸菌活菌数在发酵初始阶段迅速上升,在16 h时达到最大值5.79×107CFU/g,此时SOD活性为269.84 U/g,当发酵时间超过16 h时,乳酸菌活菌数出现下降趋势,说明此时接近植物乳杆菌生长繁殖的活跃期。综合考虑,选择发酵时间8～24 h进行优化。

2.4.2 乳酸菌接种量的确定

乳酸菌接种量对SOD活性和乳酸菌活菌数的影响见图9。

图9 乳酸菌接种量对SOD活性和乳酸菌活菌数的影响Fig.9 Effect of inoculation amount of lactic acid bacteria on SOD activity and viable number of lactic acid bacteria

由图9可知,当乳酸菌接种量较低时,SOD活性及乳酸菌活菌数都较低,当乳酸菌接种量为2%时,SOD活性达到最大值270.47 U/g,此时继续增大接种量,乳酸菌活菌数先小幅度上升后开始出现下降趋势,而SOD活性急剧下降,这是因为当乳酸菌初始菌种密度过大时,其生长代谢速度过快,发酵过度,产生的总酸含量过高,影响了SOD的活性[21]。因此,选择接种量1.5%～2.5%进行优化。

2.4.3 发酵温度的确定

发酵温度对SOD活性和乳酸菌活菌数的影响见图10。

图10 发酵温度对SOD活性和乳酸菌活菌数的影响Fig.10 Effect of fermentation temperature on SOD activity and viable number of lactic acid bacteria

由图10可知,随着发酵温度的增加,SOD活性和乳酸菌活菌数先略微上升,SOD活性在37 ℃时达到最大值270.83 U/g,此时乳酸菌活菌数为5.05×107CFU/g;乳酸菌活菌数在36 ℃时达到最大值5.55×107CFU/g,此时SOD活性为270.18 U/g,当温度超过37 ℃时,两个指标均随着温度的增加呈下降的趋势。因此,选择发酵时温度35～37 ℃进行后续优化。

2.4.4 乳酸菌发酵阶段正交试验

乳酸菌发酵阶段正交试验结果及分析见表6。

表6 乳酸菌发酵阶段正交试验结果及分析Table 6 Orthogonal test results and analysis of lactic acid bacteria fermentation stage

由表6可知,3个因素对SOD活性影响的主次顺序为A>C>B,即发酵时间>发酵温度>乳酸菌接种量,最优组合为A3C3B2,即发酵时间为24 h,发酵温度为37 ℃,乳酸菌接种量为2%,在此条件下进行发酵,测得SOD活性为(264.98±2.23) U/g,乳酸菌活菌数为(1.48±0.17)×108CFU/g;3个因素对乳酸菌活菌数影响的主次顺序为A>B>C,即发酵时间>乳酸菌接种量>发酵温度,最优组合为A2B2C1,即发酵时间为16 h,乳酸菌接种量为2%,发酵温度为35 ℃,在此条件下进行发酵,测得SOD活性为(275.24±1.12) U/g,乳酸菌活菌数为(1.97±0.17)×108CFU/g,优于组合A3C3B2。因此,以发酵时间16 h、乳酸菌接种量2%、发酵温度35 ℃为最适发酵条件。

3 结论

在酵母菌与乳酸菌复合发酵的条件下发酵刺梨果渣,经响应面分析得出酵母菌发酵阶段的最优条件为发酵时间24.5 h、糖添加量5%、发酵温度24.7 ℃、酵母菌接种量0.21%,在此条件下刺梨果渣酵素发酵物料的SOD活性为267.64 U/g,酵母菌活菌数为1.41×108CFU/g;在正交试验优化乳酸菌发酵阶段,通过分析得到最佳条件为发酵时间16 h、乳酸菌接种量2%、发酵温度35 ℃,在此条件下刺梨果渣酵素发酵物料的SOD活性为275.24 U/g,乳酸菌活菌数为1.97×108CFU/g。

刺梨果渣酵素经优化后,其活菌数显著增加,这与郭玉如[22]的研究结果相似,说明酵母菌和乳酸菌对刺梨果渣发酵具有积极影响;其SOD活性较大,多发酵产品高[23-24],说明刺梨果渣在发酵过程中能很好地保留其原有和发酵所产生的营养基质,这与王霞等[17]的研究结果一致,因此,后期可进一步对该产品进行功能性研究,以探究其生理功能。