上官琳晖,丁文文,刘佳宇,范阔海,尹伟,孙娜,孙盼盼,李宏全*
(1.山西农业大学 动物医学学院/中兽医药现代化山西省重点实验室,山西 晋中 030801;2.山西农业大学 实验动物管理中心,山西 晋中 030801)
猪圆环病毒2 型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus type 2 associated disease,PCVAD)主要病原体[1]。PCV2 感染后主要侵害机体免疫系统,表现为感染猪外周血和免疫器官中淋巴细胞大量凋亡,致使感染猪出现免疫抑制并继发感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)、猪细小病毒和猪流行性腹泻病毒等多种病原体[2-3]。在PCV2 感染猪体内,其抗原主要存在于树突状细胞(Dendritic cell,DC)中[4]。体外实验表明,PCV2 在体外感染树突状细胞后,会抑制DC 成熟增强DC 内吞作用,减弱DC对T 淋巴细胞的刺激作用[5]。因此,探讨PCV2 与树突状细胞相互作用的机制是有必要的。
DC 作为功能最强的抗原呈递细胞(Antigenpresenting cell,APC),在免疫反应中起捕获外来抗原的作用[6]。但是病毒也可以通过干扰DC 功能来逃避机体的抗病毒免疫反应并导致持续感染[7],或者利用DC 摄取抗原后向淋巴结迁移的特性以DC 为媒介在体内传播[8-9]。研究表明,PCV2感染机体后,以巨噬细胞或树突状细胞为靶细胞,单核细胞来源的树突状细胞(Mononuclear-derived dendritic cells,MoDC)中持续存在并保持感染性;这种现象表明DC 可能是PCV2 在体内传播的媒介[10-11]。
外泌体(Exosome,Exo)是一种由细胞释放的细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs),直径为30~150 nm,呈椭圆或圆形盘状[12-14]。外泌体可通过传递其所携带的内容物(蛋白质、脂质、mRNA、miRNA、tRNA 等)参与细胞间的分子传递来调节受体细胞的生理状态[15]。在病毒感染中,外泌体可以通过内容物变化,对机体的抗病毒作用产生影响[16]。MicroRNA(miRNA)是一类内源性非编码小RNA,大小为19~25 nt,在细胞凋亡、免疫功能和肿瘤发生等过程中发挥调节作用,通常会导致靶基因转录后沉默[17-18]。研究表明,病毒感染会引起宿主细胞中miRNA 表达量的变化,差异miRNA 又可以通过靶向宿主或病毒的基因转录,来调节病毒感染过程和宿主的免疫反应[19],如PRRSV可以通过上调感染细胞中miR-382-5p 和miR-30c表达,抑制Ⅰ型IFN 产生,促进PRRSV 的感染和复制[20-21]。病毒与miRNA 这种相互作用可以被外泌体介导。PCV2 感染PK-15 细胞后,PK-15 外泌体可以通过上调miR-125a-5p 来抑制靶基因Bcl-2 表达,从而激活线粒体凋亡通路,抑制脾淋巴细胞增殖[22-23]。
课题组前期研究发现,PCV2 感染MoDC 后,在MoDC 来源外泌体中检测到病毒成分,但PCV2感染后是否可以引起MoDC 来源外泌体中miRNAs 变化,以调节机体免疫反应目前尚不清楚。因此,本研究通过建立PCV2 感染猪MoDC 模型,对正常MoDC 来源外泌体(DEX)与病毒感染的MoDC 来源外泌体(VDEX)中miRNA 进行高通量测序,旨在探明PCV2 影响下VDEX 中差异表达miRNAs 及其靶基因的变化规律,为明确PCV2 感染的分子机制提供思路。
PCV2-SH 毒株由南京农业大学姜平教授提供,经PK-15 增殖后测定病毒TCID50 为10-5.38。选取1 月龄临床健康且PCV2 阴性长白猪,购自太谷县冠农农牧科技有限公司,采集前腔静脉血20 mL,使用猪外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分离液试剂盒(天津灏洋)提取PBMC。将PBMC 在MoDC 诱导培养基中培养6 d,每隔天更换半量培养基,即可得到MoDC。
1.2.1 建立MoDC 感染PCV2 模型
将所得MoDC 接种到96 孔板中,每孔5×104个细胞,37 ℃孵育12 h。弃去原培养基,加入2%1640 培养基和感染复数为1 MOI 的PCV2 病毒液,同时设置空白细胞对照组,每组3 个重复孔,病毒作用于细胞2 h 后弃去病毒液,加入2% 1640 培养基,培养至48 h。使用PCV2 间接免疫荧光检测试剂盒(中国兽医药品监察所)检测MoDC 是否感染PCV2。
1.2.2 外泌体制备及鉴定
超高速离心法提取DEX 与VDEX。将细胞培养液转移到10 mL EP 管中,1500 r·min-1,离心10 min,去除细胞沉淀;6000 r·min-1,4 ℃,离心10 min,去除死细胞;15 000 r·min-1,4 ℃,离心30 min,去除细胞碎片;31 200 r·min-1,4℃,离心90 min,弃去液体,1 mL 预冷PBS 完全溶解沉淀后,补满PBS;31 200 r·min-1,4℃,离心90 min,弃去液体,100 μL 预冷PBS 重悬沉淀,经0.22 μm 滤器过滤后分装,-80 ℃保存。
纳米颗粒追踪技术(NTA)检测:使用超纯水清洗Zeta View PMX 110 样本池,聚苯乙烯微球(110 nm)校准机器,PBS 溶液再次清洗样本池,将DEX 与VDEX 样品使用PBS 溶液稀释后上机检测。
Western blot 检测:分别取100 μL 溶于PBS 的DEX 与VDEX 提取总蛋白,二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)法测蛋白浓度,Western blot 鉴定外泌体表面标志物CD63 和TSG101,一抗Anti-CD63 antibody(Abcam)和TSG101 Polyclonal Antibody(三鹰生物)以5% BSA 封闭液按1:1000 稀释,二抗Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)-HRP(全式金)以TBST 按1∶40 000 稀释。
1.2.3 Small RNA 测序
TRIzol 法分别提取DEX 与VDEX 组总RNA,用于Small RNA 文库制备。使用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits 试剂盒制备Small RNA 测序文库,由联川生物技术公司完成测序。
1.2.4 测序结果分析
使用ACGT101-miRNA 软件对miRNA 测序结果进行分析。原始数据经过质控处理后得到clean reads,留碱基长度在18~26 nt 序列,再将其与各种RNA 数据库(mRNA 数据库、RFam 数据库和Repbase 数据库)序列比对与过滤,最后获得有效数据,对有效数据进行进一步鉴定和预测分析。
1.2.5 miRNA 表达和差异分析
将DEX 组和VDEX 组miRNA 表达量归一化到同一数量级,每组样品拷贝数=原始拷贝数×算法校正因数;当miRNA 表达量>1000 为高表达,表达量在10~999 之间为中表达,表达量在0~9 之间为低表达。miRNA 差异倍数(Fold change,FC)=VDEX 组均值/DEX 组均值,采用独立样本T 检验分析两组样品间miRNA 差异显著性,当|Log2(FC)|>1 时,如P<0.01 则miRNA 表达差异极显著;0.01
0.05 时miRNA 差异表达不显著。选择差异最显著40 个miRNA(校正P值FDR 最小的3.14e-08~9.70e-04)利用百迈克云平台热图绘制软件绘制了聚类热图。
1.2.6 miRNA 靶基因预测和富集性分析
使用TargetScan(v5.0)和miRanda(v3.3a)对差异显著(P<0.05)的miRNA 进行靶基因预测。在TargetScan算法中保留阈值为TargetScan score≥50,miRanda Energy<-10,两款软件筛选结果取交集即为miRNA 靶基因。对靶基因进行GO 功能和KEGG通路富集分析。
1.2.7 目标miRNA 的qPCR 验证
根据测序所得miRNA 序列采用加尾法在DNAMAN 9 软件中设计miRNA 上游引物(表1),引物序列由西安擎科生物科技有限公司合成,下游通用引物由M5 miRNA qPCR Assay Kit 提供。使用Easy Pure® miRNA Kit 试剂盒(全式金)提取并纯化DEX 与VDEX 中miRNA,根据M5 miRNA cDNA Synthesis Kit(聚合美)说明书进行操作,qPCR 反应体系20 μL:2×M5 miRNA qPCR Mixture 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 7.2 μL。PCR 反应条件:95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s,60 ℃退火/延伸1 min,共40个循环;熔解曲线15 s。目的基因表达量用2-ΔΔCt法计算。
表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence
miRNA 测序结果用独立样本t检验和超几何检验进行分析。qRT-PCR 结果t-test 检验显著性;P<0.05 表示差异显著,P<0.01 差异极显著。用GraphPad Prism 5.0 软件作图。
PCV2 Cap 蛋白是由ORF2 所编码的病毒衣壳蛋白,是PCV2 目前唯一已知的结构蛋白,具有良好的免疫原性,常用来作为PCV2 的检测[22]。感染PCV2 的MoDC 培养48 h 后,]间接免疫荧光(IFA)检测PCV2 Cap 蛋白,用荧光倒置显微镜观察。未感染病毒的MoDC 正常细胞对照组(图1A,图1C)中未观察到特异性绿色荧光;MoDC 在感染PCV2 48 h 后,荧光显微镜下可观察到特异性的绿色荧光为Cap 蛋白(图1D,图1F),并且可以观察到Cap 蛋白在MoDC 内表达(图4F)。结果表明,MoDC 可以被PCV2 感染,PCV2 体外感染MoDC 模型建立成功,达到后续提取外泌体的细胞要求。
图1 PCV2 感染MoDC 48 h 后PCV2 Cap 蛋白分布Fig.1 Cap protein distribution of PCV2 after PCV2 infection with MoDC in 48 h
DEX 与VDEX 鉴定结果如图2 所示。粒径检测颗粒分析技术结果见图2A,2 组外泌体直径集中在120 nm 左右。从两组MoDC 培养基上清中经超速离心所得的沉淀物,免疫印迹检测结果见图2B,沉淀物均表达外泌体标志性蛋白质CD63 和TSG101。NTA 和WB 结果表明,超高速离心所得沉淀物为外泌体。
图2 外泌体鉴定Fig.2 Identification of exosomes
DEX 和VDEX 的miRNAs 表达量差异表达miRNAs 有908 个。表2 给出差异极显著前10 个miRNA。差异表达miRNAs 火山图(图3)显示,与DEX 组相比,VDEX 组差异表达显著有504 个miRNAs(P<0.05),VDEX 组特异性高表达新miRNA 有3 个,分别是:miPC-3p-11758_454、miPC-3p-7555_705 和miPC-5p-3971_1298;特异性中度表达有61 个。DEX 组特异性高表达有3个,分别是:ssc-miR-4332_L-1R-1、ssc-miR-142-3p 和ssc-miR-150;特异性中表达有156 个,特异性低表达87 个。即PCV2 侵入树突细胞外泌体以后激活了64 种miRNA 表达,遏止了246 个miRNA 表达。
图3 差异表达miRNA 火山图Fig.3 Volcano plot of differentially expressed miRNA
表2 PCV2 感染外泌体中差异极显著miRNA(前10)Table.2 Highly differentiated miRNAs in PCV2-infected exosomes (Top 10)
图4是用miRNA 差异极显著前40 个miRNA聚类分析,特异性仅在DEX 中表达miRNA 有11个,仅在VDEX 组表达8 个;共表达miRNA 有21个:其中19 个miRNA 在VDEX 中显著降低,仅有2 个上调。
图4 差异表达miRNA 聚类热图Fig.4 Complex heatmap of differentially expressed miRNA
GO 富集分析气泡图显示(图5),差异miRNA的靶基因富集在细胞核中的数量最多,其次是蛋白结合功能;富集程度最高的是激酶活性、其次是氧化还原酶活性;靶基因富集数量多同时富集程度高是在细胞质。结果表明差异miRNA 的靶基因可能广泛参与调控细胞功能和生物学过程。
图5 差异表达miRNA 靶基因GO 富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of differentially expressed genes in miRNA
KEGG 通路分析气泡图(图6)显示,差异miRNA 的靶基因富集在癌症通路的数量最多,其次是单纯疱疹病毒1 感染通路;富集程度最高的通路是T 细胞受体(TCR)信号通路,其次Th17 细胞分化通路、再者是B 细胞受体信号通路和FCγR-介导吞噬作用;靶基因富集数量多同时富集程度高的是内吞作用通路。TNF 信号通路、人白细胞病毒1 感染(HTLV-1)、人类免疫缺陷病毒1 型感染(HIV-1)、类风湿关节炎通路、流体剪切力与动脉粥样硬化、趋化因子信号通路等均与免疫相关。
图6 差异表达miRNA 靶基因KEGG 富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes
选择VDEX 组特异性高表达的3 个miRNAs,极显著上调ssc-miR-10b 和PC-3p-29629_167 ,极显著下调ssc-miR-140-3p_L-1、ssc-miR-532-5p、 ssc-miR-425-5p、 ssc-miR-210、 ssc-miR-144_R+1 和ssc-miR-34c 的靶基因及其富集KEGG 通路(表3)。把12 个miRNAs 预测靶基因作为研究对象,以红色四边形节点为miRNA,紫色圆形节点为对应的靶基因,箭头代表靶向关系,构建miRNA-Target 的调控网络图(图7),其中VDEX 组特异性高表达miPC-3p-7555_705 处于中间位置,与ssc-miR-10b 共同调控TNF 表达,与特异性高表达miPC-5p-3971_1298 共同调控TRIM52 和SMAD3,与ssc-miR-140-3p_L-1 共同调控IL2 和PPP3CA,还有ssc-miR-532-5p 调控IL2,与ssc-miR-34c 共同调控转录因子FOSL1。另外,IL-2 及受体家族IL2RG、IL2RA、IL2RB,原癌基因AKT 家族等、转录因子、NFKBIA、NFKBIE、NFATC1 家族均是与免疫调控密切相关的基因。
图7 12 个miRNA-靶基因网络图Fig.7 Network diagram of 12 miRNA-target genes
在表达差异显著miRNA 中进一步筛选,保留P<0.001 和| Log2(FC)|≥2.0 的猪源已知miRNA,再参照KEGG 结果筛选可能参与病毒感染和免疫相关的目标miRNA。最后选出10 个目标miRNA:ssc-miR-199a-3p-R-1、ssc-miR-532-5p、ssc-miR-425-5p、ssc-miR-210、ssc-miR-144-R+1、ssc-let-7c、ssc-miR-107-R-2、ssc-miR-22-5p-R-1、ssc-miR-296-3p-R+1 和ssc-miR-10b。对筛选出10 个目标miRNA 进行qPCR 验证,结果表明,与DEX 相比,ssc-miR-532-5p、ssc-miR-425-5p、ssc-miR-210、ssc-miR-144-R+1、ssc-let-7c、ssc-miR-107-R-2、ssc-miR-22-5p-R-1 和 sscmiR-296-3p-R+1 在VDEX 中表达量均显著降低(P<0.05;图8),与测序结果一致;ssc-miR-199a-3p-R-1 和ssc-miR-10b 在VDEX 中表达量显著降低(P<0.05),与测序结果不一致,这可能由于我们未使用测序样本进行验证,并且这2 组基因表达量偏低,从而导致结果上下调不一致。
图8 目标miRNA qPCR 验证Fig.8 qPCR verification of target miRNA
DC 是目前所知抗原递呈功能最强大的抗原递呈细胞,能有效激活初始T 细胞,参与机体的免疫调节。Vincent 等[24]研究发现,感染了PCV2 的DC 与T 细胞共培养一段时间后,虽然观察到T 细胞与DC 产生了细胞接触,但未观察到病毒转移。这表明,在PCV2 感染中,感染了PCV2 的DC 可能不通过细胞接触的方式调节机体的抗PCV2 感染。DC 分泌的外泌体具有调节多种免疫细胞细胞活动的功能。Tkach 等[25]通过将DC 分泌的各类外泌体分别添加进CD4+T 细胞培养体系中与T 细胞共孵育。结果发现,DC 分泌的外泌体均可以激活CD4+T 细胞,促进CD4+T 细胞增殖及分化。另外,在肿瘤研究中,发现外泌体还可以通过向受体细胞传递MHC Ⅰ、补体活化相关物质以及抗原成分,促进T 细胞和B 细胞的活化,增强抗肿瘤免疫反应[26-28]。为了探究感染了PCV2 的DC 是否可以通过VDEX 途径进行免疫调节,本研究通过高通量测序技术获得了DEX 与VDEX 中miRNA 差异表达谱,与DEX 相比,VDEX 中表达差异显著的miRNA 有504 个(P<0.05),其中上调的有161个,下调的有343 个。对差异显著的miRNA 进行靶基因预测、GO 富集分析和KEGG 富集分析,差异显著miRNA 共预测到13 204 个靶基因(P<0.05),GO 富集分析得到具有显著性的GO 条目1752 条(P<0.05),KEGG 富集分析得到具有显著性的通路203 条(P<0.05)。
GO 富集分析结果显示,差异miRNA 的靶基因主要参与的生物学功能有转录调控(DNA 模板)、RNA 聚合酶Ⅱ对转录的正/负调控、信号转导和氧化还原等过程,KEGG 通路富集显示,差异miRNA 靶基因在TNF 信号通路、Th17 细胞分化通路、T 细胞受体信号通路、癌症通路、B 细胞受体信号通路、自噬通路和AMPK 信号通路等信号通路显著富集。因此,DEX 与VDEX 的差异主要集中在转录调控、信号转导、细胞核、T 细胞受体信号通路等方面。这些差异表明,VDEX 可能通过参与转录调控和T 细胞受体信号通路介导免疫过程。
其中ssc-miR-122 通过与PK-15 细胞中的3’UTR 结合,下调活化T 细胞5 核因子(NFAT5)和嘌呤霉素敏感氨基肽酶的表达,抑制PCV2 的蛋白质表达和病毒DNA 复制[29]。miR-30a-5p 靶向自噬调节因子14-3-3 基因,并在调节细胞周期中发挥作用。miR-30a-5p 的过表达可以通过增强自噬来触发PCV2 复制,而miR-30a-5p 的阻断显著降低了PCV2 的复制[30]。miR-15a 的上调通过介导细胞周期蛋白D1 和E 的降解促进了PCV2 诱导的G0/G1 细胞周期阻滞,有助于病毒的有效复制[31]。在本研究中,ssc-miR-122 的上调以及miR-30a-5p 的下调可能解释PCV2 在DC 细胞中没有检测到明显的病毒复制。PCV2 通过上调miR-23a 和miR-29b,激活PI3K/Akt1 和p38 MAPK 信号,抑制IL-12p40 的表达。同时,抑制ssc-miR-23a 和ssc-miR-29b 可以减轻PCV2 对IL-12p40 的抑制作用,导致IL-12p40 表达和Th1 细胞群增加[32]。IL-12p40 是IL-12 的p40 亚基,其可以诱导Th1 的促炎功能,从而将先天免疫反应和适应性免疫反应联系起来[33]。提示ssc-miR-23a 和ssc-miR-29b可能与T 细胞极化和宿主免疫反应有关。在PCV2 亚临床感染猪中miRNA 126-3p,miRNA 126-5p,let-7d-3p,mir-129a 和mir-let-7b-3p 上调,而mir-193a-5p,mir-574-5p 和mir-34a 下调,推测这些miRNA 可以参与与免疫系统相关的途径[34]。
本研究通过结合差异miRNA 显著性P 值,Fold-change 以及KEGG 分析结果,选出可能参与VDEX 介导免疫反应的10 个目标miRNA。在这10 个miRNA 的预测靶点中,存在调控T 细胞增殖分化的靶点。ssc-miR-10b 靶向IL2RA 基因,IL2RA 可以通过激活调节性T 细胞(Treg)来抑制效应T 细胞的活化和增殖[35,36]。ssc-miR-532-5p、ssc-miR-107-R-2 和ssc-miR-296-3p-R+1 靶向TAF1 基因,TAF1 是CD4+CD25+FoxP3+Treg 细胞主要转录子FoxP3 的启动子,有促进Treg 分化增殖的作用[37]。ssc-miR-107-R-2 靶向STAT3,STAT5 基因,研究发现STAT3 和STAT5 可作用于Treg 的分化过程,未成熟树突状细胞外泌体中miR-683 可以通过调节STAT3,STAT5 的表达促进Treg 分化[38]。
随后,我们对目标miRNA 进行qPCR 验证,检测miRNA 在正常组和病毒组中的相对表达量,结果发现qPCR 结果与测序结果基本一致。由此可知,VDEX 可能是通过调控T 细胞的增殖分化来调节免疫反应。虽然本研究获得了感染PCV2 的MoDC 外泌体中差异表达miRNA 的一些信息,但仍然存在一些不足,本研究仅限于基因水平,缺乏在动物模型中的验证,我们将在后期试验中进一步验证本次发现。
本研究通过比较DEX 和VDEX 中差异表达miRNA 来进行生物信息学预测分析,结果发现差异miRNA 靶基因主要参与转录调控,并且多集中于T 细胞受体信号通路。由此我们推测PCV2 感染后表达量变化最大的13 种miRNA 可能是VDEX 调节免疫反应的效应物质之一。本试验为深入研究PCV2 与DC 感染的相互作用以及对PCV2 的防治提供了新思路。