结直肠癌组织中吻素-1、周期蛋白E 的表达及其临床意义

陈文倩，丁晓璐

（1.常熟市第一人民医院肿瘤科；2.常州市第一人民医院病理科，江苏 苏州 215500）

结直肠癌是严重危害人类生命健康的常见消化系统恶性肿瘤，虽然各种综合治疗手段不断发展，但总体生存率依旧欠佳，其原因主要是远处转移高发生率及肿瘤局部高复发率，因此抑制和治疗结直肠癌远处转移是影响患者预后重要因素。结直肠癌的发生和进展呈多因素、多阶段性，与多个癌基因的激活和过度表达、抑癌基因及脱氧核糖核酸（DNA）修复基因突变或功能缺失密切相关。目前，肿瘤细胞形成的分子机制及其与癌基因和抑癌基因的关系已成为研究热点。吻素-1（Kiss-1）是从黑色素瘤细胞株中发现的一种肿瘤转移抑制基因，具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，正常情况下Kiss-1 在正常组织中表达较多，但在肿瘤组织，特别是消化系统肿瘤，如在胃癌、食管癌中等表达常常缺失，表明Kiss-1 参与了肿瘤的发生、发展过程[1-2]，但其具体作用尚不明确。Cyclin E 属于细胞周期蛋白家族，在正常组织中该蛋白表达较低或不表达，有报道称，Cyclin E 与恶性肿瘤有关，如乳腺癌中Cyclin E 过量表达与肿瘤发生及其恶性表型和不良预后密切相关[3]。本研究旨在探究Kiss-1、Cyclin E 在结直肠癌组织中的表达情况，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性分析常熟市第一人民医院2016 年1 月至2020 年3 月收治的85 例结直肠癌患者的临床资料，取其结直肠癌组织标本与结直肠癌癌旁正常组织标本，分别作为结直肠癌组、癌旁组。诊断标准：参照《结直肠癌诊疗规范（2015 年版）》[4]中的相关诊断标准。纳入标准：符合上述诊断标准，并经电子结肠镜检查取活检病理、影像学检查及术后标本送病理检查等确诊者；年龄≥ 18 岁；术前无放化疗、免疫治疗、靶向治疗、中医治疗等治疗史者；临床资料完整者等。排除标准：多源性肿瘤或多发癌者；存在炎症性肠病、家族性腺瘤性息肉病者；合并血液系统、免疫系统疾病者等。院内医学伦理委员会已批准此研究实施。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 所有手术切除标本包括肿瘤组织和癌旁正常组织。癌旁正常组织为距癌组织边缘5 cm 以上的正常组织，常规进行石蜡阻滞连续切片，切片厚度为4 μm。

1.2.2 免疫组化检测 采用柠檬酸高温高压对切片进行抗原修复，加入封闭血清，室温孵育30 min，随后弃去血清，加入抗Kiss-1 或抗Cyclin E 一抗进行4 ℃过夜孵育，磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）漂洗3 次，5 min/次，加入二抗室温孵育1 h，PBS 漂洗3 次，5 min/次，最后采用3, 3-二氨基联苯胺（DAB）显色，镜下控制反应时间。获得满意染色效果后，切片自然晾干，采用酒精、二甲苯梯度脱水透明，中性树脂封片。显微镜下观察Kiss-1、Cyclin E 的阳性表达情况。免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。以PBS 代替一抗作阴性对照。

1.2.3 结果判定标准 Kiss-1 表达定位于细胞质和细胞膜，呈浅黄色、黄色、棕黄色或棕褐色颗粒。Cyclin E 主要表达于细胞核内，均表现为棕黄色或黄色颗粒。以染色强度作半定量评分，Kiss-1 免疫阳性反应物主要着色于胞浆，Cyclin E 主要着色于胞核，根据染色强度分为：无染色为0 分，浅黄色为1 分，棕黄色为2 分。根据阳性细胞所占比例进行评分：阳性细胞所占比例小于5%计为0分，5%≤阳性细胞所占比例＜25%计为1 分；25% ≤阳性细胞所占比例＜50%计为2 分；50% ≤阳性细胞所占比例＜75%为3 分；阳性细胞所占比例≥ 75%计为4 分。结合染色强度分数和阳性细胞所占比例分数，两者相加，＞3 分为阳性表达，≤ 3 分为阴性表达[5]。

1.3 观察指标①观察结直肠癌组织与结直肠癌癌旁组织Kiss-1、 Cyclin E 表达情况。②分析结直肠癌组织Kiss-1、Cyclin E 阳性表达与患者临床病理特征的关系。其中临床病理特征包括年龄、性别、肿瘤直径（＜3 cm 或≥ 3 cm）、分化程度[6]（高分化：75%以上癌细胞分化良好，呈低度恶性；中分化：25%~75%的癌细胞分化良好，呈中度恶性；低分化：分化良好的癌细胞小于25%，呈高度恶性）、浸润深度、神经侵犯（有或无）、脉管侵犯（有或无）、淋巴结转移（有或无）、远处转移（有或无）、临床分期[6][根据T、N、M 分期综合评估，T 分期（T1、T2、T3、T4a）、N 分期（N0、N1、N2）、M 分期（M0、M1），包括Ⅰ期（T1~2、N0、M0）、Ⅱ期（T3~4b、N0、M0）、Ⅲ期（T1~4b、N1~2、M0）、Ⅳ期（任何T、任何N、M1a~1b）]

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0 统计学软件分析数据，计量资料经K-S 法检验均符合正态分布，以(±s)表示，行t检验；计数资料以[ 例(%)]表示，两组间比较行χ2检验，多组间比较行χ2趋势分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌与癌旁正常组织中Kiss-1、Cyclin E 蛋白阳性表达情况比较结直肠癌组中Kiss-1 阳性表达患者占比显著低于癌旁组，Cyclin E 阳性表达患者占比显著高于癌旁组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。免疫组化染色显示，Kiss-1 阳性免疫反应物主要表达在细胞胞浆，呈现深棕色反应，阳性反应细胞比例约35%，见图1-A；Cyclin E 的阳性免疫反应物主要表达在细胞核，呈现深棕色反应，细胞核染色较深，阳性反应细胞比例约60%，见图1-B。

图1 结直肠癌组织Kiss-1、Cyclin E 免疫组织化学染色阳性图片（×400）

表1 结直肠癌与癌旁正常组织中Kiss-1、Cyclin E 蛋白阳性表达情况比较[例(%)]

2.2 结直癌组织Kiss-1、Cyclin E 表达与患者临床病理特征的关系Kiss-l 蛋白阳性表达中低分化、有淋巴结转移、Ⅲ+Ⅳ分期患者占比均显著低于Kiss-l 蛋白阴性表达；Cyclin E 蛋白阳性表达中有淋巴结转移、Ⅲ+Ⅳ分期患者占比均显著高于Cyclin E 蛋白阴性表达，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 结直肠癌组织Kiss-1、Cyclin E 表达与患者临床病理特征的关系[例(%)]

3 讨论

结直肠癌的发病机制众多，临床治疗靶点有限，探究新兴研究靶点与已知治疗靶点的相关性，有利于结直肠癌的精准靶向治疗，因此，在结直肠癌发病早期制定特异性的诊疗方案和找出能预测患者预后的特异性标志物已成为癌症治疗的研究热点。

Kiss-1 作为人类肿瘤转移抑制基因，编码145 个氨基酸的蛋白质和19 个氨基酸的信号肽，定位于1 号染色体短臂3 区2 带。Kiss-1 可大量表达于正常组织中，包括中枢神经系统、消化系统等部位，其中以胎盘组织中的表达水平最高，而表达缺失主要在多种存在转移的肿瘤组织中，临床研究已经表明，Kiss-l 与黑色素瘤、甲状腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌、胃癌等的转移密切相关[7]。Kiss-1 基因首先在黑色素瘤细胞株中发现，其基因表达产物可显著抑制肿瘤细胞的增殖，同时诱导肿瘤细胞的分化和凋亡[8]。当结直肠癌组织Kiss-1 表达降低时，其编码产物多肽与配体GPR54 的结合减少，导致肿瘤细胞的基质金属蛋白酶活性增强，肿瘤细胞增殖、集落形成能力提高，肿瘤进一步发生侵袭、转移，导致患者预后较差[9]。本研究中，结直肠癌组中Kiss-1 阳性表达患者占比显著低于癌旁组；Kiss-l蛋白阳性表达中低分化、有淋巴结转移、Ⅲ+Ⅳ分期患者占比均显著低于Kiss-l 蛋白阴性表达，提示Kiss-1 蛋白在结直肠癌组织中呈低表达，且Kiss-1 的表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移、临床分期有关。因此，监测Kiss-1蛋白表达有希望成为评估结肠癌高危因素和恶性生物学行为的标志物。

Cyclin E 主要表达于细胞核，是细胞周期G1期的正向调节因子，其调控细胞增殖主要是通过缩短G1期，引起中心体过增殖，干扰有丝分裂，形成不稳定的染色体，从而诱发肿瘤形成[10]。本研究中，结直肠癌组中Cyclin E 阳性表达患者占比显著高于癌旁组；Cyclin E 蛋白阳性表达中有淋巴结转移、Ⅲ+Ⅳ分期患者占比均显著高于Cyclin E蛋白阴性表达，提示Cyclin E 蛋白在结直肠癌组织中呈高表达，且Cyclin E 的表达水平与淋巴结转移、临床分期有关。相关研究中，Cyclin E 的高表达对细胞的凋亡产生抑制作用，不仅提高结直肠癌细胞的生存能力，还参与结直肠癌的侵袭和转移，其表达水平可能成为判断结直肠癌预后的潜在指标[11]。张庚等[12]研究结果显示，在结肠镜所取结直肠癌组织中Cyclin E 阳性率为66.3%，而邻近正常黏膜组织中Cyclin E 阳性率仅为23.7%，并且结直肠癌组织中其表达与原发肿组织分化、临床分期呈显著正相关，说明Cyclin E 过度表达可能与结直肠癌的发生及进展有关。

综上，Kiss-1 蛋白在结直肠癌组织中呈低表达，Cyclin E 蛋白在结直肠癌组织中呈高表达，且Kiss-1、Cyclin E 的表达水平与患者临床病理特征有关，早期可通过检测上述指标对患者的病情进行判断，为临床后续治疗提供一定的参考依据。