可逆性肾动脉狭窄大鼠模型的建立与评估

周 爽 ，李学东*，付鸿江，孔宣柱

（1.承德医学院研究生学院，河北 承德 067000；2.泰达国际心血管病医院血管外科，天津 300457）

肾血管性高血压（renovascular hypertension, RVH）通常是由肾动脉闭塞或肾动脉狭窄（renal artery stenosis,RAS）而引起肾脏灌注压下降，激活肾素 - 血管紧张素 - 醛固酮系统（RAAS），最终导致血压升高。RAS 引起的RVH 是继发性高血压最常见的病因，其中动脉粥样硬化性肾动脉狭窄（atherosclerotic renal artery stenosis,ARAS）是引起RAS 最主要的病因，约占RAS 患者的80%[1-2]。两肾一夹肾性高血压大鼠（2K1C-RHR）模型是研究肾血管性高血压最常见的动物模型之一，最初有研究应用不同尺寸的银夹缩窄狗的肾动脉进行模型的制作，从而为RVH 产生的机制及对其他器官影响的研究奠定了基础[3-4]。然而，由于传统的银夹材质软，易变形，内径容易发生改变，且容易脱落，往往会造成模型的成功率下降。基于此，本研究使用食品级硅胶管缩窄肾动脉，既可保证RAS 程度一致，又可以避免RAS 的材料脱落，从而提高模型重建成功率。在2K1C-RHR 大鼠模型建立成功后，还需恢复狭窄的肾动脉，以满足肾动脉血运可以复通的条件，本研究模拟临床中的肾动脉血运重建的过程，并探究模型的可逆性，为今后研究降压药与支架置入术对大鼠血压的影响奠定基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物55 只体质量为250~300 g 的健康Sprague Dawley（SD）雄性大鼠，SPF 级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2017-0005，饲养于天津市滨海新区医学动物实验中心。所有动物实验方案均符合泰达国际心血管病医院动物伦理委员会相关规定与条例。

1.2 实验方法

1.2.1 实验前的准备 实验开始前，将大鼠置于带有垫料的鼠笼，并置于专门饲养大鼠的屏障中，自由进食、饮水，室温保持在25 ℃左右，对大鼠进行至少1 周的适应性喂养。将50 只大鼠按照随机数字表法分为狭窄3 d组（10 只）、狭窄5 d 组（10 只）、狭窄7 d 组（10 只）、狭窄14 d 组（10 只）和狭窄21 d 组（10 只），将另5 只同类大鼠作为假手术组。除了假手术组外，其他统称为模型组。术前3 d 所有大鼠均灌胃阿司匹林肠溶片（石家庄康力药业有限公司，国药准字H13024364，规格：25 mg/片），剂量为9 mg/kg 体质量，1 次/d，连续使用3 d。

1.2.2 模型构建及解除肾动脉狭窄方法 术前禁食12 h后，使用装有异氟烷（天津瑞普生物技术股份有限公司，兽药字020037015，规格：100 mL/瓶）的小动物麻醉机（天津德鸿盛生物科技有限公司，型号：DHS-MS-3）对大鼠进行吸入麻醉。将大鼠置于37 ℃的恒温加热垫上，固定四肢，剃除腹部毛发，碘伏消毒术区皮肤。于肋弓下腹正中线外侧偏左0.5~1 cm 处作一长2~3 cm 的切口纵行切开，用组织剪将肌肉剪开相应大小的开口，充分暴露腹腔后，用纱布将左侧的结肠和小肠推至右侧显露左侧肾脏，将左侧肾动脉与肾静脉分离，管径较细的为肾动脉，粗的为肾静脉，如图1-A 所示。在靠近主动脉处的肾动脉上套入内径为0.30 mm，厚约1 mm 的食品级硅胶管，如图1-B 所示。手术结束后，取出腹腔内的纱布，处理干净渗液，仔细检查腹腔内无出血和肠管损伤后，恢复肠管的生理位置，然后用5-0 丝线依次间断缝合关闭腹膜、肌肉及皮肤。假手术组的大鼠除了没有进行肾动脉缩窄外，其他操作均与模型组相同。术后继续灌胃使用阿司匹林至解除狭窄的前1 天，剂量同术前。模型组的大鼠分别于术后3、5、7、14、21 d 时拆除软管，均再次打开腹腔，仔细分离肾动脉周围组织并取出置入的硅胶管，其中狭窄7 d 组大鼠取出硅胶管后肾动脉如图1-C 所示。各模型组大鼠取出硅胶管后，仔细检查腹腔内无出血和肠管损伤后，恢复肠管的生理位置，然后用5-0 丝线依次间断缝合关闭腹膜、肌肉及皮肤，术后观察1 h，然后单独饲养，允许自由进食和饮水。每次手术结束后，各大鼠均肌肉注射头孢呋辛钠（深圳信立泰药业股份有限公司，国药准字H20000410，规格：0.75 g/支），剂量为0.2 g/kg 体质量，3 次/d，连续使用3 d。

图1 模型构建及解除肾动脉狭窄示意图

1.2.3 血压测量方法 清醒状态下的大鼠，在肾动脉狭窄模型建立前、解除肾动脉狭窄前、解除肾动脉狭窄后分别用小动物无创血压测量仪（北京众实迪创科技发展有限责任公司，型号：ZS-BPIV）测量收缩压（SBP）。测量前，将保温桶调节至适当温度，并诱导大鼠进入温度适宜且具有黑暗环境的保温桶中，用鼠袋裹住保温筒，将测压气囊置于鼠尾根部，待其安静至少10 min 再进行测量，测量3 次SBP，取平均值。

1.3 观察指标①比较假手术组和模型组大鼠肾动脉狭窄前后SBP 差值（ΔSBP）。②比较假手术组和模型组大鼠解除肾动脉狭窄前后ΔSBP。

1.4 统计学方法所有数据均使用SPSS 23.0 统计学软件进行分析，计量资料经S-W 法检验均符合正态分布且方差齐，以(±s)表示，两组间比较行t检验，多组间比较采用重复测量方差分析，两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 假手术组与模型组大鼠肾动脉狭窄前后ΔSBP 比较狭窄3 d 组和狭窄14 d 组的大鼠在狭窄术后各死亡1 只，狭窄21 d 组大鼠解除狭窄后死亡2 只。与狭窄前比，解除狭窄前模型组各组大鼠SBP 均显著升高，且狭窄14 d 前随着狭窄时间的延长，SBP 升高越明显，狭窄14 d 后SBP 升高缓慢，狭窄14 d 组狭窄前后ΔSBP 显著高于其他各组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1、图2。

表1 假手术组与模型组大鼠狭窄前后SBP 及ΔSBP 比较(mmHg，±s)

表1 假手术组与模型组大鼠狭窄前后SBP 及ΔSBP 比较(mmHg，±s)

注：与狭窄前SBP 值比，*P＜0.05；与狭窄3 d 组比，#P＜0.05；与狭窄5 d 组比，△P＜0.05；与狭窄7 d 组比，▲P＜0.05。SBP：收缩压。1 mmHg=0.133 kPa。

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图2 假手术组与模型组大鼠狭窄前后ΔSBP

2.2 假手术组与模型组大鼠解除狭窄前后ΔSBP 比较与解除狭窄前比，解除狭窄后模型组各组大鼠SBP均显著下降；与狭窄3 d 组比，狭窄5 d 组、狭窄7 d 组大鼠的ΔSBP 均显著升高；狭窄7 d 组大鼠ΔSBP 显著高于狭窄21 d 大鼠，且狭窄21 d 组低于狭窄5 d 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3、表2。

表2 假手术组与模型组大鼠解除狭窄前后ΔSBP 比较(mmHg，±s)

表2 假手术组与模型组大鼠解除狭窄前后ΔSBP 比较(mmHg，±s)

注：与解除狭窄前SBP 值比，□P＜0.05；与狭窄3 d 组比，#P＜0.05；与狭窄5 d 组比，△P＜0.05；与狭窄7 d 组比，▲P＜0.05。

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3 讨论

虽然2K1C-RHR 大鼠模型已经广泛应用于各项研究中，但有文献报道，用血管夹制作的2K1C-RHR 大鼠和小鼠的模型成功率低[5-6]，其原因是各种材质的血管夹均存在一定的缺陷。制作2K1C-RHR 大鼠模型的银夹，银是最早应用于2K1C-RHR 大鼠模型的材料[7]，由于银的延展性好，易于变形，操作过程中会由于术者的力度不均，导致RAS 的程度不能保持一致，结果将会导致得到的大鼠SBP值不准确。如果狭窄程度轻，则血压上升缓慢，甚至血压可能不会发生明显改变；如果变形严重，将会导致其在动物体内极易滑脱，导致模型的失败率增高。戴勇等[8]用丝线和针灸针缩窄肾动脉，将针灸针与肾动脉平行放置，用丝线将两者系在一起，然后撤出针灸针，造成肾动脉狭窄。理论上针灸针去除后能够留出部分空隙，使肾动脉缩窄为理想直径，实际上，丝线结扎的力度无法保持一致，结扎力度大，狭窄程度大，结扎力度小，狭窄程度小；另一方面，动脉管壁具有较大弹性，即使撤除针灸针，管壁也无法恢复到理想状态，若结扎过紧会导致肾动脉闭塞。丝线的表面是粗糙的，使用丝线结扎肾动脉会损坏血管壁，易形成血栓，有可能导致肾动脉完全闭塞，模型失败率增大。用钛夹和针头缩窄肾动脉同样存在弊端，当针头与肾动脉并行放置时，由于钛夹呈V 形，使用钛夹将肾动脉和针头一起夹住时，夹子会留有一定的空隙，肾动脉也许会滑到空隙中，并不能确保肾动脉被均匀的缩窄成理想中的程度[9-10]；用钛夹制作2K1C-RHR 大鼠模型，会损伤血管壁，破坏管壁弹性，导致肾动脉无法顺利地恢复血运。

综合以上模型的不足，本研究最终决定采用一种内壁光滑的圆形内径材料，可以均匀地收缩肾动脉，而且不会对肾动脉管壁造成伤害，受操作者手法的影响小。本研究采用内径为0.30 mm 的食品级硅胶管收缩肾动脉，大鼠SBP升高明显。结果可以发现，在狭窄3 d 时SBP 开始升高，并且在狭窄14 d 左右达到高峰，事实证明此方法可以在相对短时间内成功制作RVH 模型。根据研究结果可知，SBP不会随着狭窄时间的延长无限增高，本实验肾动脉只有一侧狭窄，考虑另一侧健康的肾脏会起到代偿的作用，因而肾动脉狭窄到一定时间时，SBP 不会再继续明显升高，反而会有轻度下降的趋势，但基本不会下降到正常范围，肾动脉狭窄程度不同，大鼠SBP 升高程度也不同。

拆除硅胶管后，肉眼可见肾动脉管腔内有血流通过，动脉搏动和管壁弹性仍然存在。选择肉眼观察有一定局限性，因此本研究仍然通过血压变化判断肾动脉血运是否恢复。由本研究表2 结果发现，拆除硅胶管后，即肾动脉狭窄解除之后，大鼠SBP 下降。使用硅胶管缩窄肾动脉，不仅可以使血压升高，对肾动脉管壁不会造成明显的损伤，而且还可以使狭窄后的肾动脉恢复正常血运。此外，狭窄7 d 内SBP 均容易恢复，而狭窄14 d 及21 d 组的SBP 很难恢复到术前的水平，说明狭窄时间越长，大鼠的SBP 越不容易恢复。因此RAS 后应该尽早干预，不应该单纯将狭窄程度作为手术标准。

综上，对于2K1C-RHR 模型大鼠，在狭窄7 d 内解除RAS 其SBP 容易恢复，狭窄时间越长，大鼠的SBP 越不容易恢复，因此建立可逆性肾动脉狭窄大鼠模型是可行的，此模型的建立为今后探索最佳肾动脉血运重建的时机奠定了基础。本研究不足之处是无法真正模拟临床中RAS 形成的过程，在RAS 的病因中最常见的ARAS 形成是一个缓慢的过程，今后的实验中我们拟使用一种可以缓慢膨胀的材料，使大鼠的肾动脉呈一种缓慢狭窄的状态。