唇形科兰香草蓝色花粉形成观察与成分分析

杨庆华 葛斌杰 张大生

（1.南京林业大学生物与环境学院，南京 210037；2.上海世博文化公园建设管理有限公司，上海 200126；3.上海辰山植物园华东野生濒危资源植物保育中心，上海 201602；4.上海辰山植物园，上海市资源植物功能基因组学重点实验室，中国科学院分子植物卓越中心辰山研究中心，上海 201602）

观察发现，自然界中植物的花粉大多呈淡黄色，具有其他颜色花粉的现象非常罕见。植物的色素成分一般可以分为四大类：叶绿素、黄酮类、类胡萝卜素和甜菜苷［7］。已有研究表明，花粉的颜色主要是因为含有丰富的类胡萝卜素或黄酮类成分，故使花粉呈现出不同程度的淡黄色［7-8］。1968年，HESLOP-Harrison［9］首次发现百合（Lilium longiflorum）花粉中含有类胡萝卜素成分，但不确定类胡萝卜素如何形成以及与花粉外壁上孢粉素的形成是否存在关系。后来，在向日葵（Helianthus annuus）和金盏菊（Calendula officinalis）等植物的花粉中均陆续发现存在类胡萝卜素成分的现象［10-11］。金盏菊的花粉成分分析结果表明，毛莨黄素、花药黄质、叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素是其花粉外壁的主要成分［11］。Wakelin 等［12］发现花菱草（Eschscholzia californica）存在橙色和白色花药（突变型）品种，橙色花药中的类胡萝卜素含量要比白色的高，并且认为类胡萝卜素成分与花粉参与有性生殖的过程无明显关系。Fambrini等［13］年研究了向日葵（Helianthus annuus）的橙色、黄色和乳白色的花粉时发现，橙色花粉颜色的主要成分是由类胡萝卜素和叶黄素构成，当把橙色花粉的品种分别和黄色、乳白色的花粉的品种进行杂交时，发现F2代都是3∶1的性状分离比，提示橙色是一个受单基因控制的性状，但类胡萝卜素的形成机制及突变原因并没有深入研究。黄酮类物质在花粉中干质量比为2%～5%，主要是3 号位双糖基化或三糖基化的堪菲醇，斛皮黄酮、异鼠李素［10］，但遗憾的是，对花粉黄酮类颜色产生的机制研究目前还很欠缺。笔者在进行兰香草（Caryopteris incana）花色调查时发现其中一种兰香草的成熟花粉呈现蓝紫色，这为研究花粉表面色素的形成提供了一个很好的研究材料。兰香草是唇形科（Lamiaceae）莸属多年生草本植物，花叶并美，具有较长观赏期，且全株具迷人芳香，是一种优良的园林绿化、美化、香化植物［14］。除了观赏价值以外，兰香草还包含黄酮类、萜类、苷类、挥发油等多种化学成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用［15］。野生兰香草资源十分丰富，适应性极强，存在大量的变异类型，主要分布于我国华东、广东、广西、湖南、湖北等地，在日本与朝鲜半岛亦有分布。

由于彩色花粉的形成机制目前研究还鲜见报道，本研究拟通过显微观察方法对兰香草不同发育时期的花粉色素积累情况进行观察，并利用质谱检测花粉表面色素的成分，以期对植物花粉表面色素的形成和发生机制提供一定的理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

本试验中所用兰香草活植物于2015 年9 月引自浙江省舟山市桃花岛（GBJ04972，29.840 670N，122.237 275E），种植于上海辰山植物园（31.075 001N，121.183 037E）隔离苗圃至今，每年可正常开花结实，在6～9 月花期观察花形态特征，收集不同时期的新鲜花药和花粉用于试验。

质谱所用试剂：甲醇（色谱纯，Merck公司）；甲酸（色谱纯，Sigma-Aldrich 公司）、盐酸（优级纯，信阳市化学试剂厂）、花青素标准品（纯度大于99%，isoReag公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 不同时期花蕾、花药和花粉的观察

取不同发育时期的新鲜花蕾各3个，在体视镜（OLYMPUSLG-PS2，日本）下观察花药和花粉的颜色，取成熟花药解离花粉制成涂片，徒手切片制作花药横切面切片，在显微镜（OLYMPUSBX43，日本）下观察花粉颜色和结构。

1.2.2 花粉中花青素成分的靶向检测

2）从行业分布来看，以户外运动为主。由于户外运动参与人数众多，消费群体广，像足球、滑雪、自行车等有着充足的参与力量，使户外运动在小镇建设中有良好的资源基础；

1.2.2.1 仪器与设备

质谱检测委托嘉兴迈维代谢生物科技有限公司进行。超高效液相色谱仪（ExionLC™ AD，美国）和串联质谱（MS/MS）（QTRAP® 6500+，美国）。质谱数据用软件Analyst 1.6.3 处理。真空冷冻干燥仪（FreezeZone 6 L-84，美国）；高速离心机（5424R，德国）；电子天平（AS 60/220.R2，波兰）；球磨仪（MM400，德国）、超声波提取仪（KQ5200E，昆山舒美）、多管涡旋振荡器（MIX-200，上海）。

1.2.2.2 样品前处理

收集成熟时期的花粉进行真空冷冻干燥并研磨至粉末状，称取50 mg 的粉末溶解于500 μL 提取液（80%的甲醇水溶液，含0.1%盐酸）中；涡旋10 min，超声10 min，离心（转速12 000 r·min-1，3 min），吸取上清液，重复操作1 次；合并2 次上清液，用微孔滤膜（孔径0.22 μm）过滤样品，并保存于进样瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.2.2.3 仪器条件

液相条件包括：（1）色谱柱：ACQUITY BEH C18 1.7 μm，2.1 mm×100 mm；（2）流动相：A相为超纯水（加入0.1%的甲酸），B 相为甲醇（加入0.1%的甲酸）；（3）洗脱梯度：0 min B 相比例为5%，6 min增至50%，12 min增至95%，保持2 min，14 min降至5%，并平衡2 min；流速0.35 mL·min-1；柱温40 ℃；进样量2 μL。

质谱条件主要包括：电喷雾离子源温度550 ℃，正离子模式下质谱电压5 500 V，气帘气35 psi。在QTRAP® 6500+中，每个离子对是根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。

1.2.2.4 花青素的定性和定量分析

基于标准品构建MWDB（Metware Database）数据库，对质谱检测的数据进行定性分析。利用软件Analyst 1.6.3 处理质谱数据进行定量分析。根据标准品的保留时间与峰型的信息，对每种物质在不同样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。分别配制0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、50.00、100.00、500.00、1 000.00、2 000.00、50 000.00 mg·L-1不同浓度的标准品溶液，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据；以标品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制不同物质的标准曲线。将检测到的所有样本的积分峰面积代入标准曲线线性方程进一步带入计算公式计算后，最终得到实际样本中该物质的绝对含量数据。

2 结果与分析

2.1 兰香草蓝色花药的形态观察

本研究使用的兰香草高约50 cm，基部稍木质化。叶对生，叶片厚纸质，披针形、卵形或长圆形，两面被短柔毛。顶生和腋生聚伞花序紧密（图1A～B）。花萼杯状，外面密被短柔毛；花冠淡紫色或淡蓝色（图1C），二唇形，外被短柔毛，花冠管喉部有毛环，花冠5裂，下唇中裂片较大，边缘呈流苏状；雄蕊4枚，花开时与花柱均伸出花冠筒外，花药蓝紫色，药室纵裂，可见蓝紫色花粉粒（图1D，箭头所示处），花丝浅紫色。柱头2 裂，呈线形分叉，浅紫色。花果期6～10 月。为了排除花粉囊中其他杂质颜色的影响，将成熟花粉抖落在载玻片下进一步显微观察，可以看到花粉表面的确呈现为蓝色（图1E）。

图1 兰香草花期，花序、花、花药及花粉形态特征A.聚伞花序生于枝干上部，兼具腋生和顶生；B.开花时的花序形态，示花瓣、花药和花丝均为蓝紫色；C.开放花的结构，由外至内为：花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊；D.花药2室，纵裂后，露出蓝紫色花粉粒（箭头所指）；E.成熟时期的花粉形态Fig.1 Morphological characteristics of inflorescence，flower，anther and pollen in C.incana A.Cymose morphology of C.incana inflorescence；B.Morphology of inflorescence at mature stage，the petals，anthers and filaments were all blue-purple；C.Morphology of floret at mature stage，from outside to inside：sepals，petals，stamens and pistils；D.Dehiscent anther at mature stage，the anther had two locules，arrow indicated the blue pollen；E.Morphology of pollen at mature stage

2.2 兰香草花粉颜色的变化及存在位置

为确定不同发育阶段花药和花粉颜色变化特征，观察了4 个时期的花药和花粉的形态特征，结果如下：现蕾期（Ⅰ）、生长期（Ⅱ）、蓓蕾期（Ⅲ）、开花期（Ⅳ）的花蕾观察。结果显示，兰香草早期花蕾是一簇绿色球状小花苞，花瓣被紧紧包裹于花萼之内（图2A：Ⅰ）。随着花蕾继续发育，花萼部位出现浅蓝色色素（图2A：Ⅱ），花瓣顶端也逐渐变蓝（图2B）；剥开花蕾，此时内部的花药呈现淡黄色（图2B，箭头处），花粉囊里面的花粉也呈现为淡黄色（图2C）。花瓣随着发育逐渐变大，突出于花萼，花瓣颜色也逐渐全部转变成蓝色，此时花蕾仍然全部包裹着花药和雌蕊（图2A：Ⅲ）；剥开花瓣，内部可以看到弯曲蜷缩的花药，但此时的花药和花丝已经开始逐步转变为蓝色（图2D），显微镜下观察可以看到花粉也转变为蓝色（图2E）。最后，花丝进一步延长伸出花瓣，花瓣颜色进一步加深呈蓝紫色（图2F），成熟的花药开裂露出里面蓝色的花粉（图2G）。

图2 兰香草4个发育阶段的花药和花粉颜色的变化A.4个发育时期的花蕾形态；B～C.花蕾生长期（Ⅱ）的花形态和花药形态，示花丝和花药为浅黄色；D～E.蓓蕾初绽期（Ⅲ）的花形态（D）和花药（E），示花药深紫色，花丝为浅紫色；F～H.开花期（Ⅳ）的形态（F）、成熟花药（G）和花药徒手横切面（H），示花丝浅紫色，开裂花药和花粉均为深蓝紫色；花药横切面显示花粉囊含有两个药室，花药壁为浅黄色，而花粉粒为浅蓝色，箭头所示的绒毡层部位也为蓝紫色Fig.2 The pigment formation of anther and pollen at four different stages of C.incana A.Phenotype of flower buds at four different stages；B-C.The filament and anther morphology at stage Ⅱ of flower bud and arrow indicated that the filaments and anthers were light yellow；D-E.The filament and anther morphology at stage Ⅲ of flower bud and arrow showed that the anthers were dark purple and the filaments were light purple；F-H.The filamen（tF），mature anthe（rG）morphology and cross section of anthe（rH）at stage Ⅳ of flower bud showed that the filament was light purple，the dehiscent anther and pollen were dark purple；The cross section of the anther showed that the anther sac contained two locules，the anther wall was light yellow，the pollen grain was light blue，and the tapetum shown by the arrow was also blue-purple

为了分析花药蓝色存在的具体部位，笔者对蓓蕾期（第III 期）的蓝色花药进行徒手切片观察。结果显示，兰香草的花粉囊由2 个药室组成，每个药室中都充满了浅蓝色的花粉颗粒（图2H），蓝色花药的形成主要是由于花粉的蓝色导致。被子植物典型的药室结构一般由由外而内的外层、内层、中层和绒毡层4 层壁细胞组成［14］。通过兰香草的花药横切面可以看出，外层、内层、中层并没有色素存在，但在药室内侧，也就是绒毡层部位观察到有浅蓝色的色素形成（图2H，黑色箭头处），尤其是靠近花丝和花粉囊连接处的绒毡层，更有较深的蓝色色素（图2H，红色箭头处）。提示花粉蓝色的形成可能是由绒毡层或小孢子共同产生颜色的结果。

2.3 兰香草蓝色花粉色素成分分析

植物中能够形成蓝色的色素主要是黄酮类的花青素成分［7］，结合上述观察到的兰香草花药和花粉颜色的变化趋势，推测蓝色花粉的形成也许与花青素成分的存在有关。据此，选取了兰香草的花粉进行了花青素成分的靶向质谱定量检测。结果发现，在花粉中总共检测到6 大类花青素的14种成分（表1），包括矢车菊素、飞燕草素、锦葵色素、芍药花色素、天竺葵色素和矮牵牛花色素。其中含量最高的是飞燕草素 3-O-葡萄糖苷，为（1.720±0.260）μg·g-1，其次是锦葵花色素3，5-O-二葡萄糖苷，为（1.071±0.3t81）μg·g-1，而天竺葵类色素含量最低（表1，图3）。从这个结果可以推测，兰香草花粉的蓝色应该是由含量丰富的飞燕草素和锦葵花色素导致颜色的产生。

表1 兰香草花粉中花青素成分Table 1 Analysis of anthocyanin composition and content in pollen of C.incana

图3 兰香草花粉花青素成分分析A.矢车菊素-3，5-O-二葡糖苷；B.矢车菊素-3-O-葡糖苷；C.飞燕草素-3-O-半乳糖苷；D.飞燕草素-3-O-葡糖苷；E.锦葵色素-3，5-O-二葡糖苷；F.锦葵色素-3-O-葡糖苷；G.天竺葵色素-3，5-O-二葡糖苷；H.天竺葵色素-3-O-丙二酰葡糖苷；I.天竺葵色素-3-O-葡糖苷；J.芍药花色素-3，5-O-二葡萄糖苷；K.芍药花色素-3-O-葡糖苷；L.矮牵牛花色素-3，5-O-二葡糖苷；M.矮牵牛花色素-3-O-丙二酰葡糖苷；N.矮牵牛素-3-O-葡糖苷Fig.3 Analysis of anthocyanin composition and content in pollen of C.incana A.Cya-3，5-O-diglu；B.Cya-3-O-glu；C.Del-3-O-gal；D.Del-3-O-glu；E.Mal-3，5-O-diglu；F.Mal-3-O-glu；G.Pel-3，5-O-diglu；H.Pel-3-O（-6-O-malonyl）-glu；I.Pel-3-O-glu；J.Peo-3，5-O-diglu；K.Peo-3-O-glu；L.Pet-3，5-O-diglu；M.Pet-3-O（-6-O-malonyl）-glu；N.Pet-3-O-glu

3 讨论

花青素广泛分布于花瓣、果实、叶片和茎等组织中，是构成花瓣和果实的主要色素之一，一般存在于表皮层或皮下的一层薄壁细胞中，具有吸引昆虫传粉、抵抗紫外线、保护植物内部结构的功能。迄今为止还没有发现在植物花器官内部组织结构中存在花青素分布的情况。研究表明，大多数植物中的花青素的形成是一个受光诱导的过程，强光可以同时诱导花青素合成的结构基因和调节基因的表达，而黑暗或弱光处理下，结构基因的表达量会下调甚至不表达，从而抑制花青素的合成［15-16］。而花粉在发育早期，一直被包裹在密闭黑暗的花粉囊中，并不可能接收到光信号的刺激，因此花粉表面和绒毡层内的花青素如何形成是一个很有意思的科学问题，其合成方式可能是一个区别于经典花青素合成途径的新的机制，具有较高的理论研究价值。

目前所有发现的花青素类型都是在植物细胞质的内质网中合成并修饰，通过跨膜转运储存于细胞的液泡中，才能形成有颜色的花青素［17］。迄今为止还没有发现花青素能独立存在于细胞之外，并在细胞表面积累的现象。花粉是一个独立的细胞单元，在其成熟的阶段，花粉内充满了淀粉、蛋白等营养物质，并无液泡存在的物理空间，因此花粉细胞内一般没有花青素的存在，颜色应该是在花粉表面积累形成，我们在显微镜下也观察到兰香草花粉的蓝色的确是分布于花粉表面（图1E）。花青素究竟是小孢子发育过程中积累产生还是从绒毡层细胞分泌目前尚不清楚，但无论哪种形式的积累，由于存在小孢子细胞膜或者绒毡层细胞膜的缘故，花青素都存在一个跨细胞膜运输的过程。目前对花青素的跨膜运输机制了解还十分有限，在细胞内进行液泡膜跨膜运输时，主要通过谷胱甘肽转移酶的介导来进行［18-21］。花青素如何在小孢子或绒毡层细胞内合成并进行细胞间的运输，是一个全新的运输机制。根据兰香草花药和花粉发育的变化规律来看，在早期花粉并没有颜色出现，只是后期随着花丝变蓝，内部的花粉也开始逐渐变蓝，而花丝是和绒毡层紧密连接的结构，提示可能花粉上的花青素是从绒毡层部位最先产生，然后经过后期绒毡层细胞的分泌途径转运聚集于小孢子表面，当然这个推测的转运模式需要进一步的试验去证实。

自然界中花粉颜色的变化对植物的传粉和进化方式究竟有何重要的影响，目前这方面的研究报道还很少，并且不同的研究的结论也存在差异。毛茛科黑种草属（Nigella）不同亚属之间存在紫罗兰或黄色的花粉，但观察发现传粉者对两者花粉的颜色并没有选择性［22］。但是在北美风铃花（Campanula americana）中，喜食蜂却对不同颜色的花粉传粉具有选择性［23］。近年来，有研究认为北美风铃花的不同花粉颜色的形成可能跟纬度、天气、紫外线的强度差异有关，深颜色花粉的存在可能是对高温和强紫外环境的一种适应［24］。因此，兰花草的蓝色花粉对植物的有性繁殖、对传粉者的吸引力究竟有何影响，是否也是对自然生境的一种适应还需要进一步的试验来证实。

总之，本研究通过对兰香草蓝色花粉色素发育变化的观察，发现其花粉表面存在一种新的类黄酮成分——花青素，蓝色色素主要在花粉表面和绒毡层细胞中积累，并证实蓝色是由飞燕草素和锦葵花素的存在导致，其合成和运输方式还有待于进一步深入研究，该发现对今后研究花粉花青素的合成、调控以及花青素的跨膜运输机制具有重要的生物学意义。

致谢感谢上海辰山植物园园艺发展部蒋云工程师提供兰香草的栽培管理，科研平台部邵文高级工程师提供切片观察。