锦带花组培快繁体系的建立

李得萍，许丁帆，何远秦，杨森茹，黄俊轩，刘艳军

（天津农学院 园艺园林学院，天津 300392）

锦带花（Weigela florida）为忍冬科（Caprifoliaceae）锦带花属（Weigela）丛生灌木植物。主要分布于我国黑龙江、吉林、辽宁等地区，其花色艳丽、叶色多变、抗逆性强，是北方重要的园林观花植物[1-3]。同时，锦带花还具有抑菌、抗流感、镇痛等多种药用功效[4-5]，也可为纺织品染色[6]，以及作为防火树种[7]。

锦带花因种子微小不易采集，且种子出芽率低，生产中极少采用播种法进行大规模繁殖。其种苗繁育多采用扦插、压条或分株等繁殖方法[8]，但以上方法繁殖效率较低，且长期无性繁殖会导致病虫害的积累，影响苗木的质量。组培快繁技术具有速度快、繁殖系数大等优点，且能维持原有品种的优良特性，适应周年工厂化生产，使苗木繁殖不受自然环境中季节和恶劣气候的影响[9]。

目前，关于锦带花组培快繁方面的研究报道较多，前人在锦带花组培快繁研究中，一般先通过外植体诱导愈伤组织，进而分化出不定芽，采用不定芽再生的方式进行增殖[10-12]。然而愈伤组织诱导过程周期较长且可能产生变异[13]，导致锦带花变异植株发生频率相对较高。本试验采用茎段为外植体，通过诱导腋芽萌发增殖的方式进行离体快繁，腋芽繁殖出来的后代遗传稳定性较高，以此建立一种高效且遗传稳定的锦带花组培快繁体系，为锦带花工厂化育苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为天津农学院东校区内生长健壮、无病虫害‘红王子’锦带花植株。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行处理。计量资料以x±s表示，采用配对t检验；计数资料采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

1.2 试验方法

外植体污染率（%）＝污染外植体数/接种外植体数×100；

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剪取植株上当年生新梢中上部茎段，每个茎段带有1～2 个腋芽。用70%乙醇溶液浸泡30 s，无菌水冲洗30 s，再分别采用含有效氯1%、2%、4%的次氯酸钠溶液消毒，消毒时间设置为5、10 min，消毒后无菌水冲洗3 次，每次冲洗10 min，再用无菌滤纸吸干外植体表面水分，并剪去外植体两端褐化部分，分别接种至MS、MS＋125 mg/L羧苄青霉素培养基上。试验重复3 次，每个处理接种10 瓶，每瓶接种3 个外植体。15 d 后观察并统计不同处理的外植体污染率、腋芽萌发率及腋芽生长情况。

随着当今社会的不断发展，学校对生物学科的学习是非常重视的，生物学科的学习不仅可以帮助学生培养学习的能力，也可以为同学打开一所与外界沟通的桥梁.在生物教学的学习中，应该培养学生的核心素养，日后不近可以帮助学生对生物知识的学习，还可以培养学生的思考能力，高中生物教学的基本内容主要包括：引导学生正确看待生物科学和把生活与生物合理的进行运用和联系，因此，这三个方面培养对学生的生物学习有着非常重要的意义.

采用Excel 统计数据，并用SPSS20.0 分析软件进行显著性分析。

平均株高（cm）＝同一处理株高之和/外植体数；

Te=150 nm,t=20 nm,Dn=25 cm2/s,α和β分别取自参考文献[22]和[23]。

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将锦带花组培苗作为外植体，将其剪成2～3 cm 小段，每个茎段带有2 个腋芽，接种到不同的增殖培养基上。增殖培养基以WPM 为基本培养基，添加不同质量浓度的BA 和IAA，7 种增殖培养基分别为：WPM；WPM＋0.5 mg/L BA；WPM＋1 mg/L BA；WPM＋2 mg/L BA；WPM＋0.5 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA；WPM＋1 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA；WPM＋2 mg/L BA＋1 mg/L IAA。每个处理接种15 瓶，每瓶接种3 个茎段。30 d 后观察并统计每种处理增殖系数、增殖芽平均高度及增殖芽生长情况。

1.2.3 锦带花的增殖培养

1.2.4 培养条件

以上培养基均采用7 g/L 琼脂粉，30 g/L 蔗糖，pH 值5.8～6.0，培养温度（25±2）℃，光照强度2 000～2 500 lx，连续照明。

1.2.5 数据统计及方法

1.2.1 锦带花的外植体消毒

将肉泥分为4组，每组5份，每份10 g，每份添加0.03 g食盐和0.005 g山梨酸钾，每组肉泥添加一类发色剂，浓度分别为0.002%，0.004%，0.006%，0.008%，0.010%。烘烤温度180 ℃，时间15 min。采用色差计测定成品肉脯的红度值a*。

腋芽萌发率（%）＝萌发外植体数/接种外植体数×100；

将萌发后长至1.5～2.0 cm 的腋芽从外植体上切下，取生长状况一致的组培苗接种到不同种类的初代培养基上。初代培养基分别采用MS、B5、WPM、Anderson、White 为基本培养基。每个试验处理接种15 瓶，每瓶接种3 个腋芽，试验重复3次。30 d 后观察并统计不同基本培养基中锦带花平均株高、平均茎粗及腋芽生长情况。

平均茎粗（cm）＝同一处理茎粗之和/外植体数；

由表1 可知，随着次氯酸钠质量分数和消毒时间的增加，外植体污染率逐渐减小，外植体腋芽萌发率逐渐上升，但并非质量分数越高越好，使用4%次氯酸钠消毒10 min 后，在植株死亡的情况下MS 培养基仍出现外植体污染，污染率为10%，均为细菌污染，考虑是植株内生菌所造成。因此在处理组中加入质量浓度为125 mg/L 的羧苄青霉素进行试验，2%次氯酸钠消毒10 min 消毒效果最好，外植体污染率1.67%，腋芽萌发率98.3%。由此可知，次氯酸钠浓度过高会对植物产生毒害作用，从而影响其正常生长，甚至死亡。综合考虑外植体污染率和腋芽萌发率，最适合消毒方法为：2%次氯酸钠溶液消毒10 min，接种到MS＋125 mg/L 羧苄青霉素培养基中。

1.2.2 锦带花初代培养基筛选

适中院二班生徒，多戏迷者。乃就校舍中所悬粉板，大书特书其向日所读 《新闻报》戏广告之戏目。因之有人提议，不如即在校内演习。诸生均极赞成，即于是晚演六君子（戊戌政变纪事）。当时并无后台化装之室，更无预定脚本，即今日新剧所谓幕表者。同校他班诸生，来参观者，均赞美不置。自此一演之后，遂兴致勃勃，即于次晚又将小说《经国美谈》排演。当时排演情形，殊属可笑，一面将小说阅看，一面即付演习。事虽草率，而大致不错。故再接再厉，又连演一晚。至第三晚参观者更众，即教员亦均列席。同校生来者，均预购洋烛，持赠演员，以助膏火。演员乃取洋烛尽燃，室内通明如白昼焉。[5]38

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理方法对外植体消毒效果的影响

增殖系数＝有效芽数/接种新梢数（有效芽为芽高≥1 cm）。

表1 不同消毒处理方法对锦带花消毒效果的影响

2.2 不同基本培养基类型对锦带花生长的影响

由表2 可知，锦带花腋芽在5 种基本培养基中生长30 d 后，其平均株高、茎粗均差异显著（P＜0.05），其中Anderson 培养基中长势最弱，平均株高0.6 cm，平均茎粗2.50 cm，显著低于其他4 种培养基中的水平，不适于锦带花组培苗木的生长；基本培养基为MS 和B5 时，其平均茎粗没有显著性差异，显著高于Anderson 和White 培养基所培养组培苗，但显著低于WPM 培养基所培养的组培苗，且植株生长情况一般；当基本培养基为WPM 时植株平均株高和平均茎粗均显著高于其他基本培养基培养，且植株生长势较强。综上所述，WPM 基本培养基最适合锦带花组培苗生长，培养30 d 后，植株的平均株高为5.58 cm，平均茎粗1.7 cm，植株生长旺盛，生长情况较强（图1）。

图1 ‘红王子’锦带花组织培养和快速繁殖

表2 不同基本培养基类型对组培苗生长的影响

2.3 不同激素质量浓度配比对锦带花增殖培养的影响

不同激素处理对锦带花增殖影响不同。由表3可知，当单独加入BA 时，各处理的增殖系数均大于对照组ck，随着BA 质量浓度的增加，增殖系数由高到低再升高，当BA 质量浓度达到1.0 mg/L 及以上时生长势减弱并出现玻璃化，增殖芽的平均高度逐渐下降。因此，单独添加BA 时，0.5 mg/L 的质量浓度条件下增殖效果最好，增殖系数3.9，增殖芽平均高度1.8 cm；在同时添加BA与IAA 时，各处理的增殖系数、增殖芽平均高度进一步提升，均大于未加IAA 的处理组，其中添加1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA 的增殖效果最好，增殖系数为8.0，增殖芽高度为1.7 cm，生长势强且未出现玻璃化。其次是添加0.5 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA 的处理组，增殖系数为6.9，增殖芽高度为3.2 cm，增殖芽平均高度显著高于其他处理；2.0 mg/L BA＋1.0 mg/L IAA 条件下效果最差，增殖芽平均高度低于对照组，可见此条件并不适用于锦带花腋芽增殖生长。因此，综合考虑得出，‘红王子’锦带花最适的增殖培养基为WPM＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA。

表3 不同增殖培养基对锦带花增殖培养的影响

3 讨论与结论

植物组织培养过程中，外植体消毒是建立锦带花组培快繁体系的关键步骤。前人多采用升汞进行锦带花外植体消毒[14-18]，但升汞有剧毒、易残留，且管制较严不易获取，而次氯酸钠使用较为安全。本试验采用次氯酸钠溶液作为消毒液，使用2%次氯酸钠溶液消毒10 min 后，将外植体接种到含125 mg/L 羧苄青霉素的MS 培养基上，其污染率为1.67%，腋芽萌发率达98.3%，且腋芽生长势强。

在锦带花外植体消毒试验结果中发现，使用2%次氯酸钠消毒10 min 后接种到MS 培养基中其消毒效果并不理想，污染率达25%，然而在提高次氯酸钠溶液有效氯浓度后，外植体出现死亡现象，并且仍存在细菌污染现象，推测为锦带花植株内生菌所造成，因此试验采用添加抗生素的方法来抑制内生菌污染。通过在培养基中添加125 mg/L 羧苄青霉素后，锦带花茎段污染率显著低于未加羧苄青霉素的处理组。黄俊轩等[19]在北美海棠脱菌组培试验中，使用含有250 mg/L 羧苄青霉素和50 mg/L 卡那霉素的MS 培养基取得了理想的内生菌抑制效果。侯淑婧等[20]在花叶锦带花组织培养试验中，在初代培养基中添加480 mg/L 羧苄青霉素也有效抑制了花叶锦带花内生菌的污染。因此，抗生素在组培中对植株脱菌以及生长具有明显的促进作用，而其抗生素浓度使用差异可能与取材植株的生理状态、外植体的取材部位及老嫩程度等有关，在试验前应先进行预试验来确认使用抗生素的浓度范围。

本试验得出WPM 基本培养基更适合锦带花组培苗生长，这一结论与多位学者不一致[15，21]。WPM 培养基是经过MS 培养基改良后的低盐培养基，主要用于木本植物的培养，因此，对于锦带花组培苗的培养也适用。B5 培养基是一种低盐培养基，也有利于锦带花组培苗的生长，且生长效果优于高盐MS 培养基培养，因此，锦带花适合较低盐培养基培养。Anderson 培养基研制之初主要用于牡丹属植物组织培养[22-23]，锦带花属植物培养没有相关报道，本试验结果也表明，锦带花在Anderson 培养基中生长效果最差，不适合生长。

增殖培养常用的增殖方法有不定芽增殖和腋芽萌发增殖[24-25]。不定芽增殖通常需脱分化形成愈伤组织，再经过再分化过程形成不定芽。而在诱导愈伤组织过程中，一般会使用大量的外源植物激素促使外植体脱分化，且愈伤组织脱分化与再分化过程中，其过程复杂，激素浓度使用不当时可能会导致组培苗遗传变异的产生。本研究采用诱导腋芽萌发增殖的方式进行离体快繁，这种方式具备遗传稳定性较高、成苗速度快等优点。

本研究以锦带花带腋芽茎段为外植体，通过不同的消毒方式获得无菌苗，筛选适合锦带花组织培养的基本培养基和合适的增殖培养基，通过腋芽萌发的方式初步建立起了锦带花组培快繁体系。试验结果显示，外植体最佳消毒方法为2%次氯酸钠溶液消毒10 min 后，接种至添加125 mg/L羧苄青霉素的MS 培养基中，此方法外植体污染率仅1.67%，萌发率可达98.3%；初代培养最适基本培养基为WPM，组培苗平均株高可达5.58 cm，茎粗1.7 cm；最适增殖培养基为WPM＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA，增殖系数8.0，增殖芽高度1.7 cm，生长势强且未出现玻璃化现象。