水稻小粒突变体tm282的遗传分析和初步定位

高海京 杨芝笛

摘 要 粳稻品种中花11（ZH11）经过60Co-γ辐射诱变，得到了一个小粒突变体tm282，对其进行遗传分析和初步定位以筛选合适的粒型控制基因。农艺性状调查发现，与野生型相比，该突变体株高变矮，穗变短且稀疏，籽粒变小；组织细胞学观察可知，突变体颖壳上表皮细胞数目变少，但是细胞长度无明显变化；遗传分析表明，tm282小粒突变为单隐形核基因控制，利用多重比较分析方法将目的基因初步定位于第七染色体483 kb区段内，该区段未有相关基因报道，推测是一个控制水稻粒型的新基因。

关键词 水稻；tm282；遗传分析；基因定位

中图分类号：S511 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.12.077

水稻是全球范围内最主要的粮食作物，为全球超过50%的人口提供食物来源，提高作物品种的产量潜力是水稻育种的基本目标[1]。构成水稻产量的三要素包括粒重、穗粒数、有效穗数，其中粒重由籽粒形状和籽粒灌浆程度决定，即由粒长、粒宽、粒厚决定[2]。挖掘粒型调控的新基因不仅可以丰富粒型遗传调控网络，还可以提高水稻的产量[3]。

1 材料与方法

1.1 供试材料

小粒突变体tm282是从粳稻品种中花11（ZH11）经过60Co-γ辐射诱变得到的突变体中初步鉴定出来的。水稻在扬州大学农学院实验田种植，播种30 d后单苗移栽，每行10株，行距为20 cm，株距为15 cm，常规大田统一水肥管理，在成熟期收种晒干后低温保存。

1.2 遗传分析群体和基因定位群体构建

将tm282与ZH11回交，得到F1代，F1自交得到分离群体F2进行遗传分析，同时将tm282与珍汕97B（ZS97B）杂交得到F2群体进行初步定位，在F2群体中筛选极端表型单株与轮回亲本ZS97B回交构建BC1F2群体进行精细定位。

1.3 农艺性状考察

水稻乳熟期，选取10株长势相同的单株测量土面至穗顶（不计芒）的高度，记为株高；每株选取3个稻穗进行穗部农艺性状考察，用直尺测量穗颈节到穗顶端长度，记为穗长；选取50～100粒成熟饱满的种子，用扫描仪对粒长、粒宽、长宽比等数据进行考察。同时考察了突变体与野生型的穗粒数、千粒重、一次枝梗数、二次枝梗数等性状。

1.4 颖壳的扫描电镜（SEM）观察

在扬州大学测试中心进行扫描电镜观察。筛选发育正常的成熟籽粒，用75%酒精洗净表面，晾干；用双面胶将水稻籽粒粘在底座上，喷金；在扫描电镜（蔡司GeminiSEM 300超高分辨率场发射扫描电镜）下观察，于12×（全籽粒观察）、500×（细胞观察）倍率下观察、拍摄图像。

1.5 突变体tm282的初步定位

利用混池分组分析法（Bulked Segregation Analysis，BSA）对突变体tm282进行初步定位，在tm282与ZS97B杂交F2群体中筛选突变体极端表型（极小粒）和正常表型（大粒）各20株，将2份叶片等量混合，构成2个极端混池。利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB法）提取2个极端混池的DNA后，送武汉博越致和生物科技有限公司进行基因组测序及连锁分析[4]。

同时从F2群体中筛选极端表型单株与轮回亲本ZS97B进行回交构建BC1F2群体，从该群体中筛选不同重组类型的导入系，利用SPSS进行多重比较分析，对小粒基因進行精细定位。DNA提取采用CTAB法。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s、53～58 ℃（退火温度根据引物GC含量进行调整）退火30 s、72 ℃延伸30 s（根据扩增片段长度调整，1 min扩增1 kb）35～38个循环，72 ℃延伸10 min反应结束。

2 结果与分析

2.1 突变体tm282的农艺性状考察

通过对野生型ZH11和突变体tm282观察发现，与野生型相比突变体株高变矮（图1A），分蘖减少，穗直立、短且稀疏（图1A、图1B），水稻籽粒明显变小（图1C）。具体农艺性状考察见表1，总体来看突变体tm282穗长变短，粒数变少，二次枝梗数变少。

2.2 tm282颖壳细胞观察

对野生型和突变体成熟籽粒的颖壳上表皮进行扫描电镜（SEM）观察，在相同视野下，突变体比野生型细胞排列得更加致密（图2A、图2B）。对颖壳上表皮细胞数进行统计，发现扫描拍照视野内，野生型细胞数约为5 384个，突变体细胞数约为4 450个，细胞总数目显著减少了17.35%。野生型和突变体颖壳上表皮细胞长度平均值分别为69.5 μm和64 μm，无明显变化。综合分析，tm282籽粒变短，可能是颖壳细胞数目减少引起的。

2.3 突变体tm282的遗传分析

以突变体tm282为母本，与野生型ZH11杂交，F1代植株表型与ZH11相似；在F2代中，植株表型发生分离，与突变体表型相似的有134个单株，与野生型表型相似的有499个单株；卡方测验表明F2群体中野生型表型与突变体表型性状分离比为2.45∶1，基本符合3∶1，说明该突变体性状的变化由一对单隐性核基因控制。

2.4 BSA关联分析

为确定控制tm282小粒突变体隐形性状的基因在基因组的位置，在F2群体中选取极端小粒及正常表型与ZH11或ZS97B各20株混合构建2个极端池。对突变体tm282、ZS97B及2个极端混池进行全基因组测序。连锁分析将该基因定位于第七染色体，定位区间在18255211～21519751 bp。

2.5 tm282精细定位图

为了进一步缩小该基因区间，利用tm282突变体与ZS97B杂交得到F1植株，经过F2代分离，从F2代群体中筛选出与突变体穗型相似的单株与ZS97B回交，构建BC1F2群体进行精细定位。

通过对1 500株BC1F2群体进行基因型检测，筛选出在分子标记LInD7-280～LInD7-331发生交换的单株（包括纯合和杂合交换），最后利用杂合单株继续自交，进一步扩大群体，获得5 000株的BC1F2群体。在标记LInD7-302～LInD7-331密集标记，筛选纯合的重组单株，最终在目标区段筛选得到13种不同重组类型的纯合导入系，根据基因型分别命名为M1～M13。

如图4所示，导入系M2和ZS97B粒长较长，分别为8.01 mm和8.04 mm，与M3、M4、M5、M8及M9没有显著差异；导入系M1、M6、M11的平均粒长低于7.00 mm，与M7、M10、M12和M13没有显著差异。结合以上14种不同重组类型的基因型和粒长表型数据，最终将tm282精细定位于标记LInD7-311～LInD7-315，物理距离约为483 kb。

3 结论与讨论

本试验将tm282基因定位于水稻第七号染色体483 kb区段内，该区段中未见有关影响控制水稻粒型的基因报道，推测tm282是一个新的影响水稻籽粒大小的基因，对该基因的研究有助于进一步阐明水稻籽粒大小调控机理，发掘粒型新基因。

在所有已经克隆的调控水稻穗型和粒型的基因中，有许多一因多效基因，不仅调控水稻粒型，还参与水稻其他性状或者组织器官的发育，如直立穗基因DEP1在改变穗型的同时，导致水稻籽粒变小，株高变矮[5]。同时粒型和穗型是受多基因控制的复杂性状，不仅受到基因调控，还和水稻遗传背景和种植环境相关。如SMG12基因突变导致籽粒变短，株高变矮，一次枝梗、二次枝梗数都减少[6]。本试验的材料tm282突变体不仅在穗型粒型上有明显变化，还在株高、分蘖、穗粒数上有变化。遗传分析的结果证明了tm282突变体是一个隐性单核基因突变体。

参考文献：

[1] YAN S，ZOU G H，LI S J， et al.Seed size is determined by the combinations of the genes controlling different seed characteristics in rice[J].Theoretical and Applied Geneticis，2011，123（7）：1173-1181.

[2] 宋露，何明良，刘颖湘，等.水稻粒型调控研究进展[J].土壤与作物，2021，10（4）：363-372.

[3] 刘迪，冯连杰，梁卫红.水稻粒型调控相关信号通路的鉴定与解析[J].中国生物化学与分子生物学报，2023，39（2）：212-221.

[4] 王娟，李敏，高海京，等.一個新的水稻小圆粒突变体的遗传分析和基因鉴定[J].扬州大学学报（农业与生命科学版），2022，43（3）：12-18.

[5] ZHOU Y，ZHU J Y，LI Z Y，et al.Deletion in a quantitative trait gene qPE9-1 associated with panicle erectness improves plant architecture during rice domestication[J]. Genetics， 2009， 183（1）：315-324.

[6] 管柳蓉，刘祖培，徐冉，等.一个新的OsBRI1弱等位突变体的鉴定及其调控种子大小的功能研究[J].植物学报，2020，55（3）：279-286.

（责任编辑：张春雨）