UPLC-MS/MS法测定膨化食品中环己基氨基磺酸钠的含量

汪强 刘燕 王双寿 唐文屹 秦雅丽 张月松

摘 要：建立了一种高效、简便、准确的测定膨化食品中环己基氨基磺酸钠的超高效液相串联三重四极杆质谱法。样品以甲醇+水（1+1）提取，以亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液为沉淀剂，经过涡旋振荡、超声提取以及离心之后，取上清液过滤膜上机。采用C18色谱柱进行分离，MRM负离子模式检测，基质外标定量。结果表明，环己基氨基磺酸钠在0～200 ng·mL-1线性关系良好，相关系数＞0.999，该方法检出限为0.03 mg·kg-1，定量限为0.10 mg·kg-1。在0.200 mg·kg-1、0.500 mg·kg-1加标水平下，回收率分别为84.0%～95.0%、96.2%～99.2%，相对标准偏差均＜10%。本方法快捷、灵敏、准确，可用于膨化食品中环己基氨基磺酸钠的检测。

关键词：环己基氨基磺酸钠；膨化食品；超高效液相串联三重四极杆质谱法

Abstract： To establish a efficient， simple and accurate method for the determination of cyclamate in puffed food by ultra-performance liquid chromatography-triple quadr-upole tandem mass spectrometry. The sample was extracted with methanol + water （1+1）， and potassium ferricyanide solution and zinc acetate solution were used as precipitants， extracted by vortex and ultrasound， centrifuged and the supernatant was taken over the membrane and put on the machine. The separation was carried out on a C18 column， detected by MRM negative ion mode and quantified by matrix external standard. The results showed that the correlation coefficient of sodium cyclamate in the range of 0～200 ng·mL-1 was good with the correlation coefficients＞0.999. The limit of detection of the method was 0.03 mg·kg-1， and the limit of quantification was 0.10 mg·kg-1. The recoveries of sodium cyclamate at the spiked levels of 0.200 mg·kg-1， 0.500 mg·kg-1 were 84.0%～95.0% and 96.2%～99.2%， respectively， and the relative standard deviations were less than 10%. The method is rapid， sensitive and accurate， it can be used for the determination of cyclamate in puffed food.

Keywords： cyclamate; puffed food; ultra-performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry

現代食品企业对食品添加剂的使用，必须遵守《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[1]规定，违者必被行政处罚，情节严重的会被移送司法机关。2023年，依据《关于假肠膜明串珠菌等28种“三新食品”的公告》（2023年第1号）增补，环己基氨基磺酸钠又可添加到膨化食品这一新的领域。现行环己基氨基磺酸钠的检测标准适用范围中不包括膨化食品，为加强市场监管需要建立环己基氨基磺酸钠的检测方法。

环己基氨基磺酸钠，俗名甜蜜素，作为非营养性甜味剂[2-3]，具有甜度高、毒性小等特点，已经被广泛应用于冷冻饮品、糕点、饮料和配制酒等产品领域中[4-6]。现今检测环己基氨基磺酸钠的主要方法有气相色谱法[7-8]、气相质谱联用法[9-10]、高效液相色谱法[11-12]、高效液相色谱质谱联用法[13-14]等。目前气相色谱法比较常用，其前处理烦琐需要衍生化处理，无法适用于大批量检测活动[15]。本文使用超高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱联用仪（Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Triple Quadruple Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS），建立了膨化食品中环己基氨基磺酸钠含量的检验检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

3500型超高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱联用仪，AB（美国）；ME204E/02型天平（万分之一），METTLER TOLEDO（瑞士）；Arium-Pro型纯水机，Sartori-us（德国）；0.22 μm PTFE微孔滤膜，CNW（德国）；A100250型多管涡旋混合仪，月旭科技（中国）；GL-21M型离心机，湖南湘仪（中国）。

1.2 材料与试剂

环己基氨基磺酸钠标准物质，由天津阿尔塔公司提供，并于（20±4）℃下保存。

甲醇（CAS：67-56-1），色谱纯，TEDIA；亚铁氰化钾（CAS：13943-58-3）、乙酸锌（CAS：557-34-6）、乙酸铅（CAS：67-56-1），均为分析纯，阿拉丁；甲酸（CAS：64-18-6）、甲酸铵（CAS：540-69-2）、乙腈（CAS：75-05-6），均为质谱纯，默克；实验室用水均为超纯水。

亚铁氰化钾（92 g·L-1）：准确称取106 g亚铁氰化钾，用一定量水溶解后，再用水定容至1 000 mL。

乙酸锌溶液（183 g·L-1）：准确称取220 g乙酸锌，用一定量水溶解后，加入30 mL冰乙酸，再用水定容至1 000 mL。

硫酸锌溶液（120 g·L-1）：准确称取120 g硫酸锌，用一定量水溶解后，再用水定容至1 000 mL。

乙酸铅溶液（200 g·L-1）：准确称取200 g乙酸铅，用一定量水溶解后，再用水定容至1 000 mL。

环己基氨基磺酸钠储备液（1.0 mg·mL-1）：精密称取0.100 0 g标准物质，用甲醇+水（1+1）溶解，并用甲醇+水（1+1）定容至100 mL，配制成质量浓度为1.0 mg·mL-1的标准储备溶液，-18 ℃下避光保存，可稳定保存12个月。

1.3 实验方法

准确称取1.000 0 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇+水（1+1），再分别加入亚铁氰化钾溶液（92 g·L-1）和乙酸锌溶液（183 g·L-1）各2 mL，涡旋提取20 min，超声提取20 min，于9 000 r·min-1下离心5 min，将上清液移入50 mL容量瓶中。再用20 mL甲醇+水（1+1）重复提取一次，合并上清液，用甲醇+水（1+1）定容至刻度。过0.22 μm PTFF滤膜，供UPLC-MS/MS上机测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：C18（150 mm×3.0 mm，3 μm）；柱温：35 ℃；流速：0.3 mL·min-1；进样体积：10 μL；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸-4 mmoL·L-1甲酸铵；梯度洗脱程序见表1。

1.5 质谱条件

扫描模式：负离子模式；监测模式：MRM；电喷雾电压：-4 500 V；离子源温度：550 ℃；雾化气压：55 psi；辅助气压：55 psi；气帘气压力：30 psi；碰撞气压力：9 psi。其他参数见表2。

1.6 方法的线性范围、检出限及定量限

将含有基质的0.2 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1和200.0 ng·mL-1环己基氨基磺酸钠标准工作液上机测试，以环己基氨基磺酸钠峰面积为纵坐标，以环己基氨基磺酸钠标准工作液浓度（ng·mL-1）为横坐标，绘制线性回归标准曲线，进行外标法定量。

在空白样品中添加1 mg·kg-1的环己基氨基磺酸钠标准溶液，按实验步骤进行测定。以3倍信噪比和10倍信噪比响应对应的含量作为本方法的检出限和定量限。

2 结果与分析

2.1 提取液的选择

先对空白膨化食品进行人工添加环己基氨基磺酸钠，再分别选择甲醇、乙腈、甲醇+水（1+1）、乙腈+水（1+1）作为提取液，进行目标物的提取。甲醇、乙腈、甲醇+水（1+1）、乙腈+水（1+1）作为提取液的回收率分别为88%、90%、98%、95%。依据回收率比较结果，最终选择甲醇+水（1+1）作为提取液。

2.2 沉淀剂的选择

实验过程中使用了亚铁氰化钾溶液（92 g·L-1）与乙酸锌溶液（183 g·L-1）、硫酸锌溶液（120 g·L-1）、乙酸铅（200 g·L-1）3种不同沉淀剂分别对样品中的蛋白质进行沉淀，对比3种沉淀剂的沉淀效果。乙酸铅（200 g·L-1）的效果最好，亚铁氰化钾溶液（92 g·L-1）与乙酸锌溶液（183 g·L-1）的效果其次，硫酸锌溶液（120 g·L-1）的效果最差。由于乙酸铅具有毒性且容易堵塞色谱柱，最后选择亚铁氰化钾溶液（92 g·L-1）与乙酸锌溶液（183 g·L-1）作为本次实验的沉淀剂。

2.3 液相条件的优化

环己基氨基磺酸钠呈碱性，甲酸和甲酸铵体系呈现酸性会抑制目标物的负离子化效率，但本文确定的流动相0.1%甲酸-4 mmoL·L-1甲酸铵形成的缓冲盐体系有助于改善目标物在C18柱上的峰型并减少了其他物质的干扰。待测物的色谱图如图1所示。

2.4 定性、定量离子的选择

依据环己基氨基磺酸钠的结构特征，选择扫描模式为负离子模式，运用注射泵进样的形式，对质量浓度为500 ng·mL-1的环己基氨基磺酸钠标准溶液进行第一级质谱扫描，确定环己基氨基磺酸钠的母离子，通过碰撞气碰撞产生的碎片离子进行第二级质谱扫描，选择丰度比较高的两个碎片离子分别作为定量和定性的特征离子。两个碎片离子中响应高的离子作为定量离子，相应低的离子作为定性离子。然后对去簇电压和碰撞能量参数进行优化，使得定量、定性离子对响应达到最大，优化结果见表2。

2.5 线性范围、检出限、定量限的确定

环己基氨基磺酸钠在0～200 ng·mL-1浓度与峰面积具有较好的线性关系，回归方程为y=3 159.944 88x，相关系数为0.999 8。以取样量1.000 0 g计，此方法的检出限（S/N=3）为0.03 mg·kg-1，定量限（S/N=10）為0.1 mg·kg-1。

2.6 方法的准确度和精密度

如表3所示，样品在0.200 mg·kg-1、0.500 mg·kg-1加标水平下，回收率分别为84.0%～95.0%、96.2%～99.2%，相对标准偏差分别为2.5%～4.8%、1.1%～1.6%（n=6）。加标回收实验结果表明，此方法的准确度和精密度较好，满足要求。

3 结论

本文建立了UPLC-MS/MS测定膨化食品中环己基氨基磺酸钠的分析方法，该方法操作简单、基体干扰小，适合膨化食品中环己基氨基磺酸钠的定量和定性分析。不仅为市场监管提供了技术支持，也為人们的食品安全保驾护航。

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