丹皮酚曼尼希碱衍生物的合成及抗血小板聚集活性

顾宏霞,戴卫国,何黎琴*,吴虹

(1.皖西卫生职业学院 药学系,安徽 六安 237000;2.安徽中医药大学 药学院,安徽 合肥 230038)

心脑血管疾病(cardiovascular and cerebrovascular diseases)是心血管疾病和脑血管疾病的统称[1].近年来,心脑血管疾病早已成为全球范围内发病率和危险性最高的疾病[2].在我国,约有3.3亿心脑血管疾病患者[3],常见的有冠心病、脑梗死、静脉血栓等,是导致国人死亡的第一大病因[4],严重危害人们的身体健康和生命安全.研究表明,使用抗血小板聚集药物能够有效的预防心脑疾病的发生,降低病死率.

丹皮酚(2-羟基-4-甲氧基苯乙酮)又称牡丹酚,来源于中药徐长卿和牡丹皮,具有多种药理活性,如抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗菌、镇痛、抗炎等[5-11].研究表明,丹皮酚能降低红细胞聚集性和血小板黏附性,使红细胞变形能力显著增强,干预血栓形成的各个环节[12];丹皮酚可通过调节脂质代谢紊乱,清除氧自由基,减轻低密度脂蛋白(LDL) 及脂质过氧化反应的氧化修饰,减少细胞因子的释放,保护血管内皮细胞及抑制平滑肌细胞异常增生等,降低高脂血症患者的血小板聚集率[13].丹皮酚在防治心脑血管病方面具有较大潜力,为克服其易挥发、易代谢及水溶性差[14]等缺陷,本研究组前期对丹皮酚2-位羟基和酮羰基进行了结构修饰,合成得到了水溶性和稳定性均较好的系列的丹皮酚衍生物和丹皮酚肟衍生物,且药效结果显示部分目标化合物的体外抗血小板聚集活性优于对照药阿司匹林[15-17].

曼尼希反应(Mannich reaction),简称曼氏反应,是构建新化合物结构的常用方法,在药物合成和结构修饰中起着非常重要的作用.在先导化合物的结构优化过程中,通过Mannich反应引入曼尼希碱结构来提高药物的疗效或改善理化性质的案例有很多:比如在抗消化性溃疡药物的研发过程中,用含曼尼希碱的呋喃环置换第一代H2受体拮抗药西咪替丁结构中的咪唑环,得到了作用更强、不良反应更小、临床使用更广泛的第二代H2受体拮抗药物雷尼替丁.从喜树中提取分离得到的天然活性成分羟基喜树碱,具有良好的抗肿瘤作用,对多种恶性肿瘤均有较好的疗效,但由于其水溶性差,限制其临床使用.为此,在羟基喜树碱结构中羟基邻位引入曼尼希碱,得到了半合成衍生物拓扑替康,拓扑替康水溶性好,临床常用[18].

药效基团的杂合是一种有效的、常用的合成新型药物的方法.为探讨丹皮酚1-位酮羰基α-氢引入不同有机胺取代基团对血小板聚集作用的影响,设计合成了5个丹皮酚曼尼希碱衍生物,并对其体外抗血小板聚集活性进行评价,期望得到理想的候选药物,为丹皮酚进一步结构修饰和优化提供实验依据.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LCQ Advantage MAX型液质联用质谱仪(美国Finnigan公司);AV 400型核磁共振仪(德国Bruker公司);DF-101S智能数显磁力搅拌器(河南天辰仪器设备有限公司);薄层硅胶G板(100 mm*100 mm,合肥森瑞有限公司);旋转蒸发仪(上海贤德实验仪器有限公司);JIDI-4M台式低速自动平衡离心机(广州吉迪仪器有限公司);家兔、戊巴比妥钠、二甲基亚砜、多聚甲醛、丹皮酚、95%乙醇、浓盐酸、吗啉、哌啶、甲基哌嗪、乙基哌嗪、羟乙基哌嗪等.所用试剂均为市售分析纯或化学纯.

1.2 实验部分

1.2.1 目标化合物的合成

丹皮酚(1)与不同的有机胺经Mannich反应得到丹皮酚曼尼希碱衍生物(2a-2e).目标化合物的合成路线如Scheme 1所示.

Scheme 1 目标化合物2a-2e的合成路线

目标化合物(2a-2e)的合成通法:

将多聚甲醛(18 mmol )和丹皮酚(6 mmol)置于100 mL圆底烧瓶中,加入有机胺(12 mmol)和95%乙醇溶液15 mL,搅拌下滴加浓盐酸调反应液的pH值为4～5,于90 ℃油浴下回流搅拌反应,TLC跟踪反应进程.反应完毕,冷却至室温,减压蒸馏除去溶剂.柱色谱[甲醇∶二氯甲烷(1∶80→1∶30)],得到目标化合物.

1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(1-哌啶基)-1-丙酮(2a):白色固体,收率为35.1%.ESI-MS(m/z):264.1614 [M+H]+;1H NMR (600 MHz,CDCl3) δ 7.90 (d,J = 9.0 Hz,1H),6.56 (d,J = 8.9,1H),6.51 (s,1H),3.83 (s,3H),3.42 (t,J = 7.0 Hz,2H),3.11-2.75 (m,6H),1.70-1.61 (m,4H),1.51-1.42 (m,2H).

1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(4-吗啉基)-1-丙酮(2b):白色蜡状固体,收率47.2%.ESI-MS(m/z):266.1409 [M+H]+;1H NMR (600 MHz,CDCl3) δ 7.88 (d,J = 9.0 Hz,1H),6.51 (d,J = 9.0,1H),6.45 (s,1H),6.09(s,1H),3.79 (s,3H),3.61-3.52 (m,4H),3.19 ((t,J = 5.2,2H),2.48-2.45 (t,J = 5.0,6H).

1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-[1-(4-甲基)哌嗪基)]-1-丙酮(2c):淡黄色蜡状物,收率41.2%.ESI-MS(m/z):279.1728 [M+H]+;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 7.89 (d,J = 8.9 Hz,1H),6.63-6.47 (m,2H),3.83 (s,3H),3.65 (t,J = 7.4 Hz,2H),3.45 (d,J = 11.9 Hz,2H),3.04 - 2.90 (m,8H),2.79 (s,3H)

1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-[1-(4-乙基)哌嗪基)]-1-丙酮(2d):(淡黄色粘稠液体),收率36.0%.ESI-MS(m/z):293.2123 [M+H]+;1H NMR (600 MHz,CDCl3) δ 7.87 (d,J = 8.9 Hz,1H),6.56 (d,2H),6.46 (s,1H),3.79 (s,3H),3.19(d,J = 11.9 Hz,2H),3.04 - 2.70 (m,12H),1.22-1.12 (m,3H).

1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-[1-(4-羟乙基)哌嗪基)]-1-丙酮(2e):淡红色蜡状物),收率31.0% .ESI-MS(m/z):309.1831 [M+H]+;1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) 10.6 (s,1H),7.89 (d,J= 9.0 Hz,1H),6.54 (d,J= 8.9 Hz,1H),3.80 (s,3H),3.42-3.34 (m,4H),3.09-2.96 (m,12H).

1.2.2 药效实验[15]

取1只健康的雄性家兔,按照30 mg/kg的用药剂量,采用耳缘静脉缓慢注射戊巴比妥钠生理盐水溶液,使家兔麻醉,手术分离颈总动脉取血,收集于塑料离心管中,抗凝剂用3.2%的枸橼酸钠水溶液(抗凝剂与血体积比为1∶9).将塑料离心管置于离心机中以800 r/min的转速离心10 min,制备富血小板血浆(PRP);于离心机中以3000 r/min的转速离心10 min,制备贫血小板血浆(PPP),按Born比浊法进行血小板聚集实验.将溶于二甲基亚砜(DMSO)中,加0.9%NaCl溶液稀释至所需浓度,加样量为100 μL,终浓度为50 μmol/L.测试杯中加PRP 300 μL、溶剂或受试样品10 μL,在37 ℃预温孔内预温1 min,将测试杯转入测试通道,加入诱导剂二磷酸腺苷(ADP)(终浓度为50 μmol/L)10 μL,观察记录5 min内最大聚集率(MAR).以阿司匹林作为阳性对照品,二甲基亚砜(DMSO)作空白对照品,计算目标化合物2a-2e的血小板聚集抑制率(AIR),结果见表1.

表1 化合物2a-2e浓度为100 μg/mL时对ADP诱导的血小板聚集的抑制率

2 结果和讨论

以阿司匹林为阳性对照药品,对合成的5个目标化合物进行体外抗血小板聚集活性测试,试验结果表明,目标化合物2a-2e均具有一定抗血小板聚集的活性,且化合物2a-2e的体外抗血小板聚集活性均明显强于阳性对照物阿司匹林,其中化合物2d的抗血小板聚集活性最强,AIR值为85.39%.初步的构效关系认为,在丹皮酚1-位酮羰基α-氢引入不同有机胺取代基团,所得到的丹皮酚曼希尼碱衍生物均有一定的抗血小板聚集作用,当有机胺为乙基哌嗪、羟乙基哌嗪和哌啶时,所得的目标化合物的活性最好,均强于阳性对照药阿司匹林的2倍.当有机胺为吗啉和甲基哌嗪时,活性稍有减弱,但均强于阿司匹林.

3 结 语

本实验以丹皮酚为原料,在丹皮酚1-位酮羰基α-氢引入不同有机胺取代基团,经Mannich反应得到5个丹皮酚曼希尼碱衍生物(2a-2e),目标化合物的结构均经核磁共振氢谱和质谱确证.体外抗血小板聚集活性表明,目标化合物2a-2e均具有一定抗血小板聚集的活性,且化合物2a-2e的体外抗血小板聚集活性均明显强于阳性对照物阿司匹林,其中化合物2d的抗血小板聚集活性最强,AIR值为85.39%.