红豆杉对糖尿病肾病模型大鼠PI3K/Akt信号通路的干预作用

熊艳文, 蔡 振, 丁 阳, 周圆圆

(上海市利群医院1中医科, 2泌尿外科, 上海 200333)

糖尿病肾病是糖尿病主要的微血管并发症之一,是多基因参与的复杂疾病[1],也是导致终末期肾病和患者死亡的主要原因,其早期诊断依据是肾小管损伤和足细胞,而肾小球的高滤过是引起近端小管功能障碍的主要影响因素之一[2]。有研究表明,肾小管中的补体C3的激活,可介导免疫级联效应,导致肾脏炎症及肾部纤维化的病理改变[3]。说明免疫介导在糖尿病肾病中也发挥着重要作用。在发达国家,有20%以上的糖尿病患者在10年后会发展为糖尿病肾病,50%以上的糖尿病患者在20年后会发展为糖尿病肾病[4],若病情未能有效控制,会发展为终末期肾病。在我国,约有5%的糖尿病肾病患者进展为终末期肾病[5],严重影响患者的生活质量。因此,探讨糖尿病肾病的发展机制,寻找有效的治疗手段具有重要意义。红豆杉味甘、微苦,性平,入肺、胃、大肠经,具有解毒散积、活络止痛、利水消肿的功效[6],具有降血糖、抗氧化和抗应变性等药理作用[7]。有研究报道,红豆杉具有抑制肝糖原分解和葡萄糖吸收、降低血脂、改善自由基代谢和保护胰岛β细胞的作用[8]。PI3K/Akt作为一条经典的信号通路,具有调节糖原合成、糖代谢、细胞增殖、细胞死亡、蛋白合成等功能[9]。相关研究报道,PI3K/Akt信号通路参与糖尿病肾病的发展[10]。因此本研究旨在观察红豆杉对糖尿病肾病模型大鼠相关指标、肾脏的作用及对PI3K/Akt信号通路的影响,为红豆杉治疗糖尿病肾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康雄性SD大鼠100只,体重180～210 g,购自上海斯莱克实验动物有限公司[许可证号:SCXK(沪)2022-0004]。动物饲养于恒温22℃～24℃,灯光昼夜交替照明(12 h/12 h),5只为一笼,保证适宜活动空间,自由饮用纯净水和进食普通标准饲料,适应性饲养2周。

1.2 试剂与仪器红豆杉(重庆赛诺生物药业股份有限公司);厄贝沙坦分散片(潍坊中狮制药有限公司);PI3K/Akt信号通路靶向抑制剂LY294002、链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司);BCA蛋白质定量试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);血管细胞黏附分子- 1(VCAM- 1)、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1) (美国Proteintech Group公司);磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)一抗、羊抗鼠IgG二抗(美国Cell Signaling Technology公司);血糖和胰岛素放免试剂盒(南京建成公司);RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3 动物建模与分组100只SD大鼠中随机选取20只作为对照组(行腹腔手术但不摘除右肾,注射60 mg/kg体重生理盐水);剩余80只SD大鼠适应性喂养1周后,水合氯醛腹腔注射麻醉,摘除右肾,1周后,腹腔注射60 mg/kg体重链脲佐菌素(STZ),诱导高血糖症。72 h后,测定大鼠的空腹血糖(FPG),若空腹血糖≥16.7 mmol/L即为造模成功。80只大鼠均造模成功,随机分为模型组、厄贝沙坦组、红豆杉组、红豆杉+LY294002组,各20只。给药方法:(1)对照组给予10 mL/kg体重的生理盐水灌胃;(2)模型组给予10 mL/kg体重的生理盐水灌胃;(3)厄贝沙坦组给予17.5 mg/kg体重的厄贝沙坦灌胃;(4)红豆杉组给予3.26 mg/kg体重的红豆杉水煎剂灌胃;(5)红豆杉+LY294002组给予3.26 mg/kg的红豆杉水煎剂灌胃的同时腹腔注射2.0 ng·mL-1·kg-1体重的LY294002,连续给药8周。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠各项指标检测 药物干预8周后,收集尿液,3 500 r/min离心10 min,取上清,全自动生化仪测定各组大鼠24 h尿蛋白(24 hUTP)。10%水合氯醛腹腔注射麻醉,剖开腹腔,迅速抽取腹主动脉血,3 000 r/min离心10 min,取上清,采用血糖仪检测空腹血糖(FPG);ELISA 试剂盒检测空腹胰岛素(INS)水平;全自动生化分析仪检测胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、血肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)水平。

1.4.2 肾脏炎症损伤相关蛋白、PI3K/Akt信号通路相关蛋白检测 取约30 mg大鼠肾脏组织,研钵研碎,RIPA裂解液裂解,提取肾组织蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度,凝胶电泳分离总蛋白,转移至膜上。5%脱脂牛奶室温封闭1 h。应用VCAM-1(1∶500稀释)、PAI-1(1∶500稀释)、p-PI3K(1∶1 000稀释)、PI3K(1∶1 000稀释)、p-AKT(1∶1 000稀释)、AKT(1∶1 000稀释)、p-mTOR(1∶1 000稀释)、mTOR(1∶1 000稀释)一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶200稀释)二抗,室温孵育1 h,TBST洗膜,增强化学发光法(ECL)显色、暗室内曝光及图像分析。

1.4.3 脏器指数测定 每组取10只大鼠,迅速取双肾,分离膜组织,生理盐水清洗后吸干,称重记录肾脏重量,计算脏器指数。脏器指数=脏器重量(mg)/体重(g)×100%。

1.4.4 苏木素-伊红(HE)染色 每组取10只大鼠的肾脏组织,10%福尔马林固定,乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片3 μm。苏木精染色15 min,自来水返蓝,伊红染色2 min,酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,光镜观察大鼠肾脏病理学改变情况。

1.4.5 Masson染色 取大鼠肾脏组织,10%福尔马林固定,石蜡包埋,切片3 μm,常规二甲苯脱蜡,系列酒精水化,苏木精染色1 min,冲洗液冲洗,丽春红酸性品红液染色30 s,冲洗液清洗,磷钼酸分色6 min,亮绿蓝染色5 min,2%冰醋酸2 min,乙醇脱水,二甲苯透明,树脂固定,光镜下观察大鼠肾脏纤维化程度。

2 结果

2.1 各组大鼠相关指标的比较与对照组比较,模型组FPG、24 hUTP、TC、TG、LDL、Scr和BUN水平明显升高,INS水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,厄贝沙坦组、红豆杉组、红豆杉+LY294002组FPG、24 hUTP、TC、TG、LDL、Scr和BUN水平明显降低,INS水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中红豆杉+LY294002组以上指标变化最明显,见表1。

表1 各组大鼠各项指标比较

2.2 各组大鼠肾脏炎症损伤相关蛋白表达比较与对照组比较,模型组VCAM-1和PAI-1蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,厄贝沙坦组、红豆杉组、红豆杉+LY294002组VCAM-1和PAI-1蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),其中红豆杉+LY294002组中VCAM-1和PAI-1蛋白表达降低最明显(P<0.05),见表2、图1。

图1 各组大鼠肾脏炎症损伤相关蛋白表达

表2 各组大鼠肾脏炎症损伤相关蛋白表达比较

2.3 各组大鼠脏器指数和肾脏病理学改变与对照组脏器指数(6.25±0.37)比较,模型组大鼠脏器指数(15.21±3.46)明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组脏器指数比较,厄贝沙坦组(12.53±1.81)、红豆杉组(11.62±1.76)、红豆杉+LY294002组(9.03±1.12)大鼠脏器指数明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),其中红豆杉+LY294002组大鼠脏器指数降低最为明显。HE染色结果显示,对照组大鼠的肾小球和肾小管未见异常;模型组大鼠肾脏的病理组织结构紊乱,出现病理性损伤,肾小管间质水肿,肾小球系膜基质和系膜细胞中度增生,肾小体肿大,炎症因子浸润;经厄贝沙坦和红豆杉干预后,与模型组比较,厄贝沙坦组、红豆杉组、红豆杉+LY294002组大鼠的肾间质和肾小管病理明显改善,肾小体肿胀明显减轻;其中红豆杉+LY294002组大鼠的肾间质和肾小管病理改善最为明显,肾小体肿胀减轻最明显,见图2。

2.4 各组大鼠肾脏胶原纤维的组织学变化Masson染色结果显示,对照组大鼠肾脏组织中未观察到蓝色胶原纤维;模型组大鼠肾小球和肾小管间质中出现高密度的蓝色胶原纤维;经厄贝沙坦和红豆杉干预后,与模型组比较,厄贝沙坦组、红豆杉组、红豆杉+LY294002组大鼠的肾小球和肾小管间质中蓝色胶原纤维明显减少;其中红豆杉+LY294002组肾脏纤维化改善较为明显,见图3。

图3 各组大鼠肾脏胶原纤维的组织学变化

2.5 各组大鼠肾组织中PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的比较与对照组比较,模型组大鼠肾组织中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的比值明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,厄贝沙坦组、红豆杉组、红豆杉+LY294002组大鼠肾组织中p-PI3K/PI3K、 p-AKT/AKT、 p-mTOR/mTOR的比值明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),其中红豆杉+LY294002组大鼠肾组织中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的比值降低最明显,见表3、图4。

表3 各组大鼠肾组织中PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达比较

3 讨论

在糖尿病肾病早期,肾脏已经发生结构性病变,肾小球基底膜增厚,间质纤维化并伴有肾小管萎缩和动脉玻璃样变性[10],晚期出现大量的淋巴细胞和巨噬细胞浸润,超微结构上存在内皮细胞开窗减少或丢失[11]。肾小球病变、肾小管萎缩及间质纤维化是肾脏预后的独立危险因素,肾小球和间质病变的严重程度与肾脏预后相关[12]。有研究表明,使用肾素-血管紧张素系统抑制剂可延迟糖尿病肾病进展,保护肾脏[13],但使用肾素-血管紧张素系统抑制剂治疗时,应考虑对肾小球滤过率偏低或大幅下降患者带来的潜在风险,因此寻找有价值的治疗策略,对延缓糖尿病肾病的进展具有重要意义。红豆杉在《本草纲目》有记载,适用于治疗霍乱、伤寒和排毒,具有抗高血糖、抗惊厥、解热、抗氧化、抗炎和镇痛等多种生物学功能[14]。有研究表明,复方红豆杉胶囊在肺腺癌的治疗中具有显著疗效[15],其联合化疗治疗内分泌耐药晚期乳腺癌效果也良好,可改善患者临床证候和生存质量[16]。基于此,本研究探讨红豆杉对糖尿病肾病大鼠肾功能的改善作用以及对PI3K/Akt信号通路的影响,以便为中医药防治糖尿病肾病提供合理的实验依据。

本研究结果显示,红豆杉、红豆杉+LY294002可降低FPG、24 hUTP、TC、TG、LDL、Scr和BUN水平,提高INS水平,且红豆杉+LY294002效果最为明显。说明红豆杉在一定程度上保护肾脏免受糖尿病造成的损伤,改善血脂水平和肾功能。也有研究表明,红豆杉对糖尿病肾病大鼠肾功能有一定的保护作用[17]。糖尿病患者中PAI-1水平增高可以抑制细胞外基质降解,导致肾部纤维化[18]。VCAM-1主要介导炎症细胞在肾间质积聚,致使局部炎症反应,调节基质的黏附、增殖和聚集,促进肾部纤维化[19],说明VCAM-1和PAI-1在糖尿病肾病的炎症反应和肾部纤维化中起作用。本研究结果显示,红豆杉及红豆杉+LY294002可降低VCAM-1和PAI-1蛋白表达,表明红豆杉在一定程度上可降低炎症反应。HE染色和Masson染色观察结果显示,红豆杉及红豆杉+LY294002可明显改善肾间质、肾小管病理和肾脏纤维化,减轻肾小体肿胀。提示红豆杉在一定程度上具有改善肾脏功能,保护肾脏组织,减轻肾部纤维化的作用,且红豆杉+LY294002的作用最为明显。PI3K/Akt信号通路参与糖尿病肾病肾小球内皮细胞增殖和血管新生[20]。PI3K是激活该信号通路的关键物质,可激活下游的蛋白激酶B(Akt),会将该信号通路激活,足细胞会分泌大量的Ⅳ型胶原,使细胞外基质增多,基底膜增厚,导致肾小球硬化[5]。可见PI3K/Akt信号通路在糖尿病肾病中起重要作用。本研究结果表明,红豆杉、红豆杉+LY294002可降低大鼠肾组织中p-PI3K/PI3K、 p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的比值,其中红豆杉+LY294002降低作用最为明显。说明红豆杉对PI3K/Akt信号通路具有调控作用。

综上所述,红豆杉可能通过抑制PI3K/Akt信号通路改善糖尿病肾病大鼠的肾功能,降低炎症反应,减轻肾部纤维化,可为治疗糖尿病肾病提供依据。