花鲈仔稚鱼视觉、消化和运动等器官发育组织学观察

韩枫，张凯强，冯启超，温海深

（1.全国水产技术推广总站中国水产学会，北京 100125；2.中国海洋大学，山东 青岛 266003）

花鲈（Lateolabrax maculatus）别名板鲈、青鲈、七星鲈、寨花[1]，属广温广盐性鱼类，分布于中国沿海河口等浅海地区，以咸淡水交汇处为其理想栖息地，少部分群体具有洄游习性[2]。花鲈味道鲜美，质嫩爽口，营养丰富，广受消费者的认可，市场需求量逐年增加，养殖规模也逐步扩大，2020 年全国花鲈养殖产量达19.52 万吨，比2019 年增长8.37%，在海水鱼养殖产量中位居第二，其中，广东、福建、山东、浙江等4 省花鲈养殖产量约占全国产量90%[3]，我国每年向东北亚及欧洲地区出口花鲈3 万吨左右，其中对日本和韩国的出口量占总出口量的80%以上。作为我国重要的经济鱼类，养殖模式随着养殖产量的不断提高，逐渐从传统池塘养殖向海水网箱和工厂化养殖转变[1]。目前，南方花鲈种群生产性能下降，病害严重，而北部海域主要依赖捕捞天然苗种来满足生产需求，已成为制约花鲈养殖业发展的瓶颈，建立规模化和稳定的优质苗种生产体系已是当务之急。目前对于花鲈的研究主要包括繁殖生物学[4-9]、摄食生长[10,11]、人工育苗[12-14]、疾病与免疫研究[14-22]、种质资源调查[23,24]等，为花鲈苗种规模化繁育奠定了坚实基础。但关于花鲈仔鱼早期器官发育分化以及前期仔鱼阶段营养供应的研究较少。本研究用解剖学方法和石蜡切片技术，较详细地描述了孵出1～35 日龄（dph，day post hatching）花鲈仔鱼与摄食活动相关的眼、与营养消化相关的卵黄囊、以及与运动和生长相关的肌肉组织发育特征，以了解花鲈仔鱼组织结构特征与生理适应性之间的关系，优化花鲈苗种的早期培育方法，助力花鲈产业发展。

1 材料与方法

1.1 材料

2019 年11 月在福建省诏安县进行了花鲈的繁殖试验，所获得的受精卵空运至山东省东营市利津县双瀛苗种有限责任公司进行孵化、鱼苗培育。定时对1～35 dph 的花鲈鱼苗取样，用Bouin 氏液固定全鱼24 h 后转移至70%酒精中保存。

1.2 方法

组织样本通过梯度乙醇脱水及二甲苯透明处理后，石蜡包埋，切片（6 μm），HE 染色，中性胶封片，用OLYMPUS BX53 观察各系统器官发育情况，使用OLYMPUS cellSens Standard 进行图像采集及相关数据测量。

其中骨骼肌生长一般以特定位置特定肌节截面面积、肌纤维数量及长度等指标来衡量，测量技术较为复杂[26]。本试验中，花鲈仔鱼发育前期肌节分隔与肌纤维分隔均不明显，故采用测量特定日龄、特定位置的肌肉截面积的方式衡量骨骼肌的生长变化。选取1 dph、2 dph、3 dph、4 dph、5 dph、7 dph、9 dph、11 dph、13 dph、15 dph、20 dph、25 dph、30 dph、35 dph 仔鱼各10 尾，测量背鳍起点横切右侧肌肉面积。试验数据采用Excel 2010 软件进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 眼的组织结构

花鲈眼球构造同其他硬骨鱼类相似，由眼球壁与内容物组成（图1）。眼球壁分为三层，由外向内分别是纤维膜、血管膜与视网膜。纤维膜起保护内部组织与维持基本形态的作用，依据位置不同又可分为角膜与巩膜；血管膜起运输营养物质及废物的作用，由前向后分为虹膜、睫状体、脉络膜；视网膜是主要的成像组织，分布着大量的光敏细胞，自脉络膜向玻璃体方向可依次分为色素上皮层、视杆视锥细胞层、外界膜、外核层、外网层、内核层、内网层、神经节细胞层、神经纤维层、内界层共10 层。内容物主要起到折射光线的作用，由前向后分别是眼房水、晶状体、玻璃体。晶状体与视网膜的发生发育与仔鱼视觉能力的产生密切相关。

图1 花鲈仔鱼眼球发育组织切片Fig.1 The histological sections of morphogenesis of larval eye of spotted sea bass（Lateolabrax maculatus）

花鲈初孵仔鱼即1 dph 仔鱼的晶状体与视网膜刚开始发育。晶状体体积较小，视网膜结构不完整（图1-1）；2 dph 仔鱼晶状体体积明显增大，可以观察到角膜等组织结构（图1-2）；3 dph 仔鱼组织结构与之前并无明显差异，但眼球体积继续增大且眼球前后径增长速度快于左右径（图1-3）；4 dph 仔鱼体积变化不明显，视网膜进一步发育，可观察到视杆视锥细胞层、外核层等组织结构，内网层厚度加宽（图1-4）；5 dph 仔鱼眼部晶状体体积继续增大，视网膜构造基本完善，从脉络膜向晶状体方向可观察到色素上皮层、视杆视锥细胞层、外核层、外网层、内核层、内网层、神经节细胞层、神经纤维层等，各层区分明显，眼球发育基本完成（图1-5）；7 dph 仔鱼未观察到与5 dph 仔鱼明显不同处（图1-6）。

2.2 卵黄囊及早期消化器官的组织结构

在仔鱼发育过程中花鲈仔鱼卵黄囊与油球的体积逐渐缩小（图2），结合卵黄囊、油球体积变化趋势[7]可知：1 dph 仔鱼卵黄囊、油球处于胚后发育阶段最大时期，油球饱满，卵黄囊充盈（图2-1）；2 dph，油球体积未见明显减小，卵黄囊体积缩小，用于卵黄的消耗（图2-2）；3 dph 仔鱼在卵黄囊后端，靠近消化道处可见少数的肝脏细胞，肝脏开始发育（图2-3）；4 dph 仔鱼卵黄囊继续缩小，肝脏已见雏形，肝脏挤占了卵黄的空间，油球体积缩小（图2-4）；5 dph 仔鱼卵黄囊仅剩稍许卵黄，其余空间被剩余的油球与不断增大的肝脏占据。从纵切可见，5 dph 仔鱼消化道已经贯通且胃部已经形成（图2-5）；6 dph 仔鱼的卵黄囊中卵黄质有零星分布，油球体积明显减少，仔鱼处于混合营养阶段（图2-6）。

图2 花鲈仔鱼卵黄囊切片Fig.2 The histological sections of yolk sac of spotted sea bass（Lateolabrax maculatus）

2.3 骨骼肌的组织结构

1～35 dph 花鲈仔鱼背鳍起点横切右侧肌肉纤维面积如图3 所示。1 dph 花鲈背鳍起点横切右侧肌肉面积为（8 448.56±342.13）μm2，35 dph 花鲈为（392 338.74±32 138.61）μm2。肌肉总面积随发育时间延长呈上升趋势，且在前35 日龄中增长速率不断加快。破膜之后前7 d，肌纤维面积增长速度缓慢；7～15 d，面积增长相对平缓；15 d 之后肌纤维面积增长迅速，1～35 dph 花鲈背鳍起点横切右侧肌肉面积（y，单位μm2）与发育时间（x，单位dph）关系符合函数y=5386.3e0.1166x。

图3 不同日龄花鲈背鳍起点横切右侧肌纤维总面积及拟合趋势Fig.3 Right half fiber area in transverse section at the front dorsal fin of spotted sea bass（Lateolabrax maculatus）

花鲈前期仔鱼骨骼肌上部始于脊髓左右两端，左右两侧骨骼肌不接触，包围脊索，下部与中肾管处汇合，其他脏器不在骨骼肌包裹范围之内；发展到后期，35 dph 仔鱼横切图可看到上侧肌肉向上端生长并汇合，下部肌肉向斜下方两侧扩展，囊裹腹腔脏器，逐步接近成鱼体态（图4）。

图4 1、7、15、35 日龄花鲈横切Fig.4 Transverse histological sections of spotted sea bass（Lateolabrax maculatus）of 1,7,15,35 dph

2.4 5 dph 仔鱼全切组织结构

5 dph 仔鱼处于由自营养逐步转化为外源营养的阶段。卵黄囊、油球尚有剩余，消化道已经贯通可进行初步的摄食活动，神经、肌肉也得到了一定的发展，系统结构较为复杂。因此选择5 dph 仔鱼进行比较详细的系统观察，观察结果如图5 所示。

图5 5 日龄花鲈仔鱼横切Fig.5 Transverse histological sections of 5 dph spotted sea bass（Lateolabrax maculatus）

5 dph 仔鱼脊索贯穿全身，头部骨骼已经开始发育，包括鳃弓形成、前端脊索两侧的脊椎雏形（图5-9、5-10）。此时期油球尚未消失（图5-Ⅰ），肝脏与胰脏已开始形成并扩大（图5-6）。消化道已经贯通（图5-Ⅰ），在肠后端可观察到凹缢（图5-Ⅰ、图5-4）。凹缢之后，肛门之前的部分为直肠，无消化腺，只起到堆积粪便的作用。胃肠分隔不明显，但整体膨大，出现褶皱（图5-6、图5-5），行简单的消化作用。鳔开始发育（图5-Ⅰ），可观察到原始鳔腔、气腺、迷网等结构（图5-6）。胸鳍结构已趋于完整（图5-7），胸鳍发育要早于背鳍、臀鳍、尾鳍。心脏位于卵黄囊前端（图5-Ⅰ、图5-8），结构明显，可观察到血细胞。口咽腔中观察到鳃丝及少量泌氯细胞，较短，呼吸功能与渗透调节功能还不够完善（图5-9）。

3 讨论

3.1 眼球组织结构特征

眼球是鱼类最重要的感觉器官之一，视觉对于鱼类一系列生理活动均有影响：摄食、避敌需要依靠视觉器官获取及时的图像反馈；繁殖、集群、洄游等群体行为也需要视觉器官来维持。眼球切片的制作过程中部分样本出现了比较严重的变形，这可能与取样后未及时固定保存导致视网膜脱离有关[27]。花鲈初孵仔鱼视觉器官并不完善，视网膜分层不明显，仅能看到晶状体、色素上皮层以及较模糊的内网层等结构，这与施氏鲟（Acipenser schrenckii）[28]的研究结果相同，但与许氏平（Sebastes schlegelii）[29]、重口裂腹鱼[Schizothorax（Racoma）davidi][30]的研究结果相佐。这可能是因为花鲈孵化时间较短，视觉器官还未发育成熟，而许氏平、重口裂腹鱼孵化时间较长，视觉器官有较充足的时间进行发育。花鲈眼部发育中，晶状体的增长与视网膜的发育基本同步，晶状体是主要的折射器官，视网膜是主要的成像器官，二者同步发育可以保证仔鱼尽早完善视觉功能，早捕食。5 dph 花鲈仔鱼卵黄囊与油球消耗殆尽，开始准备摄食，此时眼部构造发育基本完成，营养消化系统与视觉器官发育节点的有效衔接保障了花鲈仔鱼从自营养到自主摄食的顺利过渡。

3.2 卵黄囊及早期消化器官组织结构特征

前期仔鱼生长发育所需要的营养主要来源于卵黄囊和油球。油球位于卵黄囊前端，其余空间充斥着卵黄，卵黄囊与油球的变化与仔鱼生长发育密切相关[7]。以往对于鱼类提供营养的器官的研究多集中在消化道、消化腺器官方面，对卵黄囊的研究多停留在发育形态特征观察水平，其组织学层面的研究较少。观察油球与卵黄囊的变化趋势可知，花鲈对卵黄囊中卵黄质的消耗速度要快于对油球的消耗速度，这与以前同属科的鳜（Siniperca chuatsi）[31]、点带石斑鱼（Epinephelus coioides）[32]的研究结果相同。此时期仔鱼肝脏功能较弱，无法有效利用脂肪，发育重点在关系基本生理活动的组织结构方面，对于富含蛋白的卵黄质消耗较多，肝脏发育之后才开始消耗油球。5 dph 仔鱼卵黄囊消耗殆尽，已经开口摄食，但是相应的消化系统功能还未发育完善，进入混合营养期，此阶段所需营养一方面来自于油球，一方面来自于所摄食的轮虫。组织学观察结合仔鱼发育形态特征观察的结果与仔鱼培育过程中所表现出来的生理活动特性相一致。

3.3 骨骼肌组织结构特征

鱼类骨骼肌占鱼体质量的30%～80%，是反映鱼体生长的重要指标[33]。骨骼肌的生长发育直接影响仔稚鱼运动能力。良好的骨骼肌发育对摄食、避敌等一些列生理活动均有重要意义。骨骼肌的生长依靠肌纤维的增生与肥大来实现，在硬骨鱼类的不同发育阶段其增生与肥大所占的比例也有不同[34]。以往关于鳜[26]、黑斑小鲷（Pagellus bogaraveo）[35]的研究中表明，仔鱼早期主要进行肌肉的分层增生，形成特定肌肉层次；后期进行马赛克增生，主要增加肌纤维数量，促使鱼体快速增长[36]。但本试验观察肌纤维分隔不明显，无法确定单个肌纤维所占区域，并没有观察到以上两个阶段，可能是因为样本保存过久或染色方法欠妥所致。花鲈7 dph 前肌肉面积增长缓慢，之后增长变快。这种现象与之前关于鳜[26]、条纹狼鲈（Morone saxatilis）[37]的研究结果相近。结合其生理特性与生长发育规律，出现这一现象的原因可能与花鲈优先选择发育神经、消化相关器官有关。前期仔鱼无法摄食，所有能源均来自于卵黄囊，此间优先发育神经、消化相关器官，可以保障在开口之后能够顺利获取食物，进行下一步发育。以往也有研究表明，在鱼类生长资源受限的阶段，会优先选择体长的增长，肌肉脂肪等在营养充足的条件下通过补偿生长机制更容易获得补充[38]。本试验从侧面也佐证了这种观点。

3.4 其他组织结构特征

5 dph 花鲈结构复杂，仔鱼前期的部分器官还未退化消失，仔鱼后期的一系列器官组织已经开始发育，是花鲈胚后发育过程中变化较为剧烈的时期。在此阶段，花鲈由内源营养转化为混合型营养，并进一步向外源性营养过渡，眼球发育基本成熟，卵黄囊基本完全消耗，胸鳍基本发育完成，运动能力得到了一定发展，中肾管已经出现。

3.5 小结

本研究对花鲈仔鱼的眼、卵黄囊、肝脏、肌肉、鳍等器官的发生、发育过程进行了组织学观察。花鲈仔鱼眼和肌肉的发生、发育，以及卵黄囊的消耗等一系列生理变化相辅相成，前期仔鱼阶段优先发育眼、肝脏、肌肉、鳍等器官，以保障视觉、消化及运动等基本能力，确保在卵黄囊耗尽之后正常摄食。本研究为了解花鲈仔鱼器官发生、发育过程提供了理论参考，还需要进一步开展免疫组化及相关基因表达等研究，以完善花鲈仔鱼组织器官发育过程。