枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊对肝脏储备功能不同的肝硬化患者的肠道屏障功能与Th9 细胞表达的影响

张笑丹 梁平 梁倞 王洪博 苏江卫

河北省胸科医院1药学部，3医学装备处，4试验部（石家庄 050041）；2河北医科大学第四医院药学部（石家庄 050011）

肝硬化是由一种或多种原因引起肝脏损害，也是各种肝病发展的晚期阶段，常见病因包括药物毒物、免疫紊乱、胆汁淤积、慢性酒精中毒、血吸虫、病毒性肝病等［1-2］。肝硬化在临床上主要表现为肝功能减退和门静脉高压，常出现多种并发症［3］。现代研究表明细菌易位及肠道菌群失调可导致肝硬化并发症，而肠道上皮屏障功能障碍是导致细菌易位的重要因素。目前，随着肠-肝轴理论的建立，肝硬化患者的肠道屏障功能得到了广泛重视与研究［4］。有研究发现，随着肝硬化患者肝脏储备功能下降，肠道的通透性增加，可诱发肝腹水的发生［5-6］。因此研究肝脏储备功能不同的肝硬化患者的肠道屏障功能，对其治疗具有重要意义。初始CD4+T 细胞在IL-4 和转化生长因子β（TGF-β）联合作用下可诱导分化为IL-9+IL-10+Foxp3-效应性T 细胞，即Th9 细胞，是当前新的CD4+效应性T 细胞［7-8］。微生态制剂（Probioties），是指运用微生态学原理，利用对宿主有益无害的益生菌或益生菌的促生长物质，经特殊工艺制成的制剂，其作用主要是调整微生态失调，保持生态平衡，提高人体的健康水平，以达到防病、治病的效果［9-10］。枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊也叫枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊，为典型的微生态制剂，能提高细胞活性，调节机体免疫，调控巨噬细胞，抑制血小板黏附［11-12］，但是对肠道屏障功能与Th9 细胞表达的影响还尚不清楚。因此，本文具体探讨了枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊对肝脏储备功能不同的肝硬化患者的肠道屏障功能与Th9 细胞表达的影响，希望为此类疾病的研究和治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取我院2020年6月至2022年8月期间接受诊疗的肝硬化患者172 例作为研究对象，纳入标准：18 ～65 岁；患者知情同意本研究；通过询问病挑选史、临床检查、实验室检查、CT 检查确诊为肝硬化，符合“病毒性肝炎防治方案”中肝硬化的诊断标准；研究得到医院伦理委员会的批准（编号：2020030619）。排除标准：（1）近2 周使用抗生素、微生态制剂及影响肠道菌群制剂；（2）合并严重的内分泌系统、免疫系统疾病；（3）不能严格遵循医嘱导致治疗无效者；合并肝癌患者；（4）精神疾病患者；（5）妊娠与哺乳期妇女。根据肝脏储备功能不同分为Child-Pugh A 级（观察组）72 例与Child-Pugh B-C 级（对照组）100 例，对比两组患者的合并疾病、体重指数、性别、年龄、病程等资料差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组一般资料对比Tab.1 Comparison of general information between two groups ±s

表1 两组一般资料对比Tab.1 Comparison of general information between two groups ±s

组别观察组对照组χ2/t 值P 值合并疾病（糖尿病/高血压/高脂血症）（例）例数72 100性别（男/女，例）38/34 55/45 0.223＞0.05年龄（岁）58.22 ± 2.48 58.02 ± 3.10 0.193＞0.05体质指数（kg/m2）22.93 ± 2.14 23.33 ± 1.04 0.332＞0.05病程（年）5.20 ± 1.44 5.09 ± 1.33 0.183＞0.05 13/12/10 18/16/15 0.241＞0.05

1.2 治疗方法 所有患者都在常规治疗手段的基础上加用肠道益生菌制剂治疗，口服枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊（枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊，北京韩美药品有限公司制造），500 mg/次，3 次/d。常规治疗包括保肝、利尿、降低门脉压力、退黄等处理。所有患者治疗观察14 d。

1.3 观察指标 （1）疗效标准：显效：天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）检查正常，临床症状与体征改善明显。有效：ALT 与AST比正常值上限小2 倍，临床症状与体征显著减轻；无效：恶化或未达到上述标准。（有效+显效）/本组例数×100%=总有效率。（2）检测肠道屏障功能：在治疗前后留取足量粪便标本，放置于-70 ℃冰箱内保存，收齐标本后统一检测肠杆菌、乳酸杆菌、白色念珠菌、肠球菌、双歧杆菌等菌属的含量，以百分比进行表述。（3）炎症因子变化对比：在治疗前后抽取空腹时静脉血3 mL，1 000 r/min共离心5 min，选择上清血清，采用酶联免疫法检测炎症因子［（白介素-6（IL-6）与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）］的表达。（4）Th9 细胞检测：采用流式细胞仪检测外周血Th9 细胞含量，每个样品设置三个复孔，取检测的平均值。

1.4 统计学方法 应用SPSS 21.00 进行统计分析，用±s表示计量资料，对比方法为χ2检验和t检验等，性别等计数资料采用百分比表示，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对比两组总有效率 对比观察组与对照组治疗后的总有效率分别为98.6%和89.0%，观察组优于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 对比两组总有效率Tab.2 Compare the total effective rate of two groups 例

2.2 肠道菌群变化对比 两组治疗前肠道菌属比较无明显差异（P＞0.05）；观察组治疗后双歧杆菌属及乳酸杆菌属较治疗前有显著增加（P＜0.05），白色念珠菌属较治疗前有明显的降低（P＜0.05），对比治疗前后对照组肠道菌群差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 两组治疗前后肠道菌群变化对比Tab.3 Comparison of changes in gut microbiota between two groups before and after treatment %，±s

表3 两组治疗前后肠道菌群变化对比Tab.3 Comparison of changes in gut microbiota between two groups before and after treatment %，±s

注：与治疗前对比，*P ＜0.05；与对照组对比，#P ＜0.05

菌群肠杆菌属肠球菌属双歧杆菌属乳酸杆菌属白色念珠菌属观察组（n = 72）治疗前15.67 ± 2.42 18.23 ± 3.02 24.02 ± 3.11 20.34 ± 2.44 20.00 ± 2.94治疗后16.29 ± 2.11 18.33 ± 3.92 27.99 ± 3.93*#23.87 ± 3.02*#18.39 ± 3.90*#对照组（n = 100）治疗前15.89 ± 2.22 17.90 ± 3.20 24.67 ± 3.10 20.54 ± 3.14 20.34 ± 2.84治疗后16.09 ± 2.11 18.33 ± 2.94 25.55 ± 3.39 21.98 ± 3.11 21.88 ± 4.11

2.3 炎症因子变化对比 对比两组治疗后血清TNF-α 与IL-6 值，观察组与对照组均低于治疗前（P＜0.05），且治疗后观察组低于对照组（P＜0.05）。见表4。

表4 对比两组患者治疗前后的血清炎症因子变化Tab.4 Comparison of changes in serum inflammatory factors between two groups of patients before and after treatment ng/mL，±s

表4 对比两组患者治疗前后的血清炎症因子变化Tab.4 Comparison of changes in serum inflammatory factors between two groups of patients before and after treatment ng/mL，±s

注：与治疗前对比，*P ＜0.05；与对照组对比，#P ＜0.05

菌群IL-6 TNF-α观察组（n = 72）治疗前288.36 ± 14.98 289.65 ± 20.37治疗后95.67 ± 18.54*#120.97 ± 22.34*#对照组（n = 100）治疗前8.64 ± 1.55 8.66 ± 1.34治疗后2.65 ± 0.98*5.01 ± 0.98*

2.4 Th9 细胞变化对比 治疗后观察组与对照组的Th9 细胞分别为（0.11±0.05）%和（0.32±0.10）%（P＜0.05），均低于治疗前的（0.82 ± 0.32）%和（0.83 ± 0.24）%，观察组Th9 细胞治疗后低于对照组（P＜0.05）。见表5。

表5 对比两组患者治疗前后Th9 细胞变化Tab.5 Comparison of changes in Th9 cells between two groups of patients before and after treatment %，±s

表5 对比两组患者治疗前后Th9 细胞变化Tab.5 Comparison of changes in Th9 cells between two groups of patients before and after treatment %，±s

组别观察组对照组t 值P 值例数72 100治疗前0.82 ± 0.32 0.83 ± 0.24 0.045＞0.05治疗后0.11 ± 0.05 0.32 ± 0.10 7.298＜0.05 t 值33.294 25.682 P 值＜0.05＜0.05

3 讨论

目前，肝硬化发病率依然较高，发病高峰年龄在35 ～48 岁［13］。肝硬化早期无明显临床表现，随着病情的发展，肝功能逐渐减退，可诱发肝功能衰竭。现代医学认为肝硬化可逆转，但缺乏理想的针对性治疗药物，且停药后常会复发。肝脏储备功能是反映肝功能状态的主要指标，一般采用Child-pugh 分级进行判定，Child-pugh 分级越高，肝脏储备功能越差［14-15］。当前研究表明肝硬化患者可出现肠道屏障功能障碍，由此产生的肠道细菌紊乱是引起肝硬化进一步恶化和促进肝性脑病发生的重要因素［16］。肠道是机体最大的内毒素池，内毒素可通过肠粘膜屏障经门静脉进入肝脏，肝硬化患者中血清中可以检测到内毒素水平变化［17］。内毒素是革兰氏阴性菌的主要重要组成，在患者肠道屏障被破坏、肠道通透性增加时，可以被释放入血液。有研究表明肝硬化肠道菌群失调，主要表现为白色念珠菌等的增加，有益菌如双歧杆菌、乳酸杆菌的减少［18］。微生态制剂不仅可以纠正肠道菌群紊乱而且能抑制肠道细菌发生易位，对肠黏膜屏障功能起到恢复和保护作用。枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊对调节人体肠道菌群失调有显著功效，其含有枯草杆菌和屎肠球菌两种活菌，对致病菌的生长有一定的抑制作用，但对肠道内有益菌的生长有促进作用［19］。本研究显示治疗后观察组与对照组的总有效率分别为98.6%和89.0%，观察组优于对照组。且观察组治疗后双歧杆菌属及乳酸杆菌属较治疗前有显著增加，白色念珠菌属较治疗前有明显的降低，而对照组治疗前后肠道菌群比较无明显差异。从机制上分析，枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊本身的双歧杆菌可平衡肠道菌群种类和数量的改变，同时枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊本身可以促进肠道有益菌的生长，也可以直接分泌代谢物质提高肠道免疫功能［20］。也有研究发现枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊可有效治疗肝硬化合并自发性腹膜炎，显改善肝硬化患者肝功能，对肠道菌群生长的微环境有明显改善，对肠道菌群失调起到调节作用［21］。同时枯草杆菌能利用自身产生的多种消化酶分解纤维蛋白、脂肪等物质，促进消化吸收，从而抑制肠道内有害细菌过度繁殖，调整肠道菌群［22］。

肠道微生物衍生的化合物及其影响的信号通路与肝硬化的进展有关。而TNF-α 是判断肠道屏蔽功能的重要指标，可破坏肠上皮细胞的屏蔽功能，增加肠黏膜的通透性，另外TNF-α 也可加重肝细胞的损伤和形成内毒素血症，从而促进其他炎性因子和氧自由基的大量释放［23-24］。研究发现，肠道神经细胞可通过分泌的IL6 起到抑制调节性T 细胞水平的作用，在神经细胞特异性缺失IL6 的肠道中，调节性T 细胞水平有所上升。另外，调节性细胞诱导菌很有可能是通过降低肠道神经系统密度和神经细胞IL6 水平的双重作用，来诱导调节性T 细胞的［25］。本研究显示对比两组治疗后血清TNF-α 与IL-6 值，观察组与对照组均低于治疗前，且治疗后观察组低于对照组。提示枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊可降低肝硬化患者IL-6 与TNF-α 的水平，来改善肝脏炎症和肠道屏蔽功能。也有研究［26］表明微生态制剂对非产氨乳酸杆菌数量的增加有显著促进作用，有效降低患者内毒素血症及血氨，50%患者的Child-Pugh 评分得到改善，这与本研究结果具有一致性。

Th9 细胞是一种新型CD4+辅助性T 细胞亚群，主要分泌IL-9，在炎症性肠病等自身免疫性疾病发挥重要作用，IL-9 通过与IL-9R 结合激活信号转导依赖性JAK-STAT 途径发挥生物学功能［27］。不过在不同的微环境中，Th9 细胞发挥不同的免疫调节功能，研究［28］发现乙肝肝硬化患者中Th9 细胞显著升高，同时也表现为肠道屏障功能紊乱，两者相互促进并参与乙肝肝硬化的发生与发展。本研究显示治疗后观察组与对照组的Th9 细胞都低于治疗前，观察组治疗后Th9 细胞低于对照组，表明枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊在治疗肝脏储备功能良好的肝硬化患者中能减少Th9 细胞，将为明确肝硬化的发病机制及治疗提供新的理论和线索。

总之，相对于肝脏储备功能差的患者，枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊在肝脏储备功能良好的肝硬化患者中的应用能改善肠道屏障功能，抑制Th9细胞表达，抑制炎症因子的表达，从而更好的发挥治疗效果。

【Author contributions】ZHENG Xiaodan performed the experiments and wrote the article.WANG Hongbo performed the experiments.LIANG Ping and LIANG Jing revised the article.SU Hongwei designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.