水痘-带状疱疹病毒特异性细胞免疫及其预测带状疱疹后遗神经痛的价值

袁峰 冯丹 李少军 张书力 李敏 胡焓 童胜雄 田佳玉

武汉市第一医院疼痛科（武汉 430022）

水痘-带状疱疹病毒（Varicella-zoster virus，VZV）感染神经节是带状疱疹（Herpes zoster，HZ）发生的病因，而其潜伏于神经节内是导致带状疱疹后遗神经痛（Post-herpetic neuralgia，PHN）的重要机制之一［1］。虽然目前对于PHN 的发生机制尚未完全阐明，但VZV 所诱导的特异性细胞免疫在其中扮演着重要角色［2］。众所周知，病毒感染后的细胞免疫是机体清除病毒的关键步骤，且各类型病毒所引起的细胞免疫具有特异性，故其对于疾病的发生及发展都具有较好的反应作用［3-4］。因此本研究拟对VZV 感染后的特异性免疫反应进行分析，并根据分析结果建立PHN 发生的预测模型，旨在为指导临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 健康人群 选择2021 年1 月至2022 年6 月于我院体检中心明确为健康的成年人10 例作为PBMC 提取对象，所有人在既往均有明确的水痘病史，且已经治愈。

1.1.2 HZ 患者 选择2021 年1 月至2022 年6 月于我院就诊的HZ 患者。纳入标准：（1）符合HZ 的诊断标准，且为初次诊断［5］；（2）年龄≥18 周岁；（3）患者或家属充分知情同意。排除标准：（1）病原学检查明确合并其他病原体感染；（2）严重肝肾功能不全；（3）合并其他自身免疫性疾病；（4）合并其他恶性肿瘤疾病；（5）严重的基础疾病；（6）经评估后可能对实验结果产生影响的其他因素。符合上述条件，并报我院伦理委员会审核通过后（编号：2100010305）共计纳入患者70例。

1.2 方法

1.2.1 PBMC 提取 抽取样本（HZ 患者取开始治疗前）清晨空腹外周静脉血3 mL，置于EDTA 管内保存，采用密度梯度离心法分离PBMC，置于-80 ℃冰箱冻存。

1.2.2 VZV 特异性细胞免疫模型构建 参照文献［6］中方案构建VZV 特异性细胞免疫模型，具体如下：将健康人群样本PBMC 分为两组，分别在含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺的完全1640 培养基（PRMI 公司生产）中解冻，并制备成1 × 107cells/mL 的PBMC 细胞液。将3 种VZV特异性肽库（gE、IE62、IE63）（由德国JPT Peptide Technologies 公司提供）混合后制备病毒浓度为10 μg/mL 的病毒液，并在96 孔U 型板（100 μL/孔，广州洁特生物过滤股份有限公司提供）加入病毒液20 μL 及PBMC 细胞液80 μL 混合作为VZV 组；1%二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO；Sigma 公司提供）20 μL 及PBMC 细胞液80 μL 混合作为对照组。两组细胞均于37 ℃下反应24 h 后，收集上清液并储存在-80 ℃下用于细胞因子检测，U 型板孔底含有细胞的悬液用于流式细胞检测。

1.2.3 流式细胞检测 采用赛默飞世尔公司提供的Attune NxT 流式细胞仪完成本次实验，主要对所有样本的T 细胞（CD3+、CD4+、CD8+）及PD-1+的CD4+T 淋巴细胞占比进行检测，结果以阳性率（%）表示。

1.2.4 VZV 特异性细胞因子检测 采用酶联免疫吸附法（ELISA）（试剂盒均由武汉塞培生物科技公司提供）测定所有样本PBMC 上清液中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素2（interleukin 2，IL-2）水平。

1.2.5 HZ患者PBMC内细胞因子检测 采用1.2.2中的方式对纳入研究的70 例HZ 患者进行PBMC细胞液制备，于37 ℃下静置24 h 后，根据VZV 特异性细胞因子检测结果，对具有差异的细胞因子进行检测。

1.3 随访方案 所有入组的HZ 患者均按照文献［5］当中的标准进行为期半年的随访，而后根据文献［7］当中对于PHN 诊断标准，统计随访期间PHN发生情况，并根据随访结果将所有患者分为PHN组及非PHN 组。

1.4 统计学方法 数据处理采用SPSS 25.0 软件。计数资料以例表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；采用COX 回归分析PHN 发生的危险因素；建立ROC曲线分析VZV 特异性细胞因子对PHN 发生的预测价值，曲线下面积（area under the curve，AUC）比较采用Z检验；P＜0.05 时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VZV 组及对照组流式细胞结果比较 VZV 组患者CD4+T 细胞占比低于对照组，而CD8+T 细胞及PD-1+CD4+T 细胞占比高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 VZV 组及对照组流式细胞结果比较Fig.1 Comparison of flow cytometry results in VZV group and control group

2.2 VZV 组及对照组细胞因子情况比较 两组患者PBMC 上清液中IFN-γ、IL-2 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），VZV 组患者PBMC 上清液中TNF-α 水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 VZV 组及对照组细胞因子情况比较Fig.2 Comparison of cytokines level between VZV group and control group

2.3 PHN组与非PHN组TNF-α、CD4+T比较 截至2022 年12 月31 日随访结束，共计6 例患者因失访视为脱落，剩余64 例带状疱疹患者中，共计17 例患者发生PHN，PHN 发生率为26.56%。两组患者临床资料比较结果提示：PHN 组患者合并前区疼痛占比、多阶段发病占比、发病至开始治疗时间及PBMC 上清液的TNF-α 水平均高于非PHN 组，CD4+T 细胞百分比低于非PHN 组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 PHN 组与非PHN 组TNF-α、CD4+T 比较Tab.1 Comparison of TNF-α and CD4+T between the two groups例（%）

2.4 HZ 患者PHN 发生风险的COX 回归分析COX 回归分析结果显示：PBMC 上清液TNF-α 水平（HR= 1.148）是HZ 患者PHN 发生风险的独立危险因素（P＜0.05），见表2。

表2 HZ 患者PHN 发生风险的COX 回归分析Tab.2 COX regression analysis of PHN risk in patients with herpes zoster ±s

表2 HZ 患者PHN 发生风险的COX 回归分析Tab.2 COX regression analysis of PHN risk in patients with herpes zoster ±s

因素发病至开始治疗时间CD4+T PBMC 上清液TNF-α合并前驱疼痛多阶段发病常量β 值0.429-0.024 0.138 0.902 1.356-10.737标准误0.342 0.024 0.045 1.069 0.972 3.827 Wald χ2 95%CI 1.574 0.934 9.383 0.712 1.946 7.873 P 值0.212 0.334 0.002 0.399 0.163 0.005 HR 1.536 0.977 1.148 2.464 3.882＜0.001下限0.786 0.931 1.051 0.303 0.577上限3.004 1.025 1.254 20.032 26.112

2.5 PBMC 内TNF-α 预测HZ 患者PHN 发生的ROC 分析 以PBMC 内TNF-α 指标建立预测PHN的ROC 曲线，结果显示：PBMC 上清液中TNF-α 对于PHN 发生具有较好的预测效果（AUC = 0.902，P＜0.001，95%CI：0.821 ～0.981），见图3。预测的截断值为＞54.36 pg/mL，预测敏感度为82.35%，特异度为85.11%，阳性预测值为66.67%，阴性预测值为93.02%。

图3 PBMC 内TNF-α 预测HZ 患者PHN 发生的ROC 分析Fig.3 ROC analysis of TNF-α in PBMC to predict PHN occurrence in patients with herpes zoster

3 讨论

PHN 的治疗一直以来是临床上HZ 相关性疼痛治疗中的难点，目前虽然通过神经阻断、富血小板血浆、中西医结合等各种治疗方式可以取得较好的疗效，但治疗不可能一蹴而就，在此过程中部分患者仍需要承受较大的痛苦［8］。早期发现危险因素较高的HZ 患者并采取多学科干预治疗方案能够减少PHN 的发病率，从源头上解决PHN发病的可能性，是目前临床上干预PHN 较好的方案之一［9］。

目前在国内针对PHN 发生的相关因素研究中，关键指标主要集中于一般临床资料。结合国外文献进行分析后，笔者认为由于临床常用的实验室检查指标中混合有多种血液细胞，会对结果产生影响［10］。本研究在设计之初经过反复验证后发现，PBMC 种类相对单一，且其中包含的淋巴细胞是参与到PHN 发生的重要因素，故作为预测因子特异性相对较好。而通过基础研究对指标进行验证后开展临床研究更具有针对性，故在临床研究前还对VZV 感染后的特异性指标进行了检测。

针对VZV 感染后的PMBC 细胞的检测结果中，各类型淋巴细胞占比差异均有统计学意义。首先，绝大部分HZ 患者是由于体内潜伏的VZV 再次活化，而CD4+T 细胞分化的记忆性CD4+T 细胞在被VZV 激活后会立即活化并启动免疫反应，从而达到抗病毒的效果［11-12］。但由于VZV 会通过抑制细胞凋亡抑制蛋白的表达并激活Fas 信号途径，从而诱导CD4+细胞的凋亡，从而达到免疫逃逸的效果，故PHN 组CD4+T 细胞会明显降低。在MERCAN等［13］的研究中指出，在VZV 病毒感染程中，CD8+T细胞会受到激活从而大量浸润到HZ 患者神经节中，从而导致疼痛的发生，这一结果与本次研究相符。可见，CD4+T 功能下降是导致VZV 再激活及发病的重要因素。在一项针对淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）的研究中指出，当PD-1/PD-L1 轴被抑制后，LCMV载量会明显下降，说明PD-1+CD4+T 细胞会与PD-L1结合并导致细胞功能抑制，从而导致病毒复制［14］。

本研究中VZV 感染后PD-1 阳性表达的PD-1+CD4+T 细胞明显升高，再次证实了VZV 可能与LCMV 病毒类似，会导致CD4+T 细胞功能抑制，从而达到促进病毒复制的作用。在选择细胞因子指标的考量上，本研究所纳入的IFN-γ、IL-2 及TNF-α均是在之前研究中被证实与PHN 之间可能存在相关性的因子［15］。而需要补充说明的是，白细胞介素中与PHN 相关的因素相对较多，但我们通过总结既往研究中PHN 患者与普通患者实验室检查指标之间的差异结果发现，IL-2 可能是导致其他白细胞介素改变的关键因素，故仅采用IL-2 代表白细胞介素加入研究［16］。通过实验结果表明，两组患者中IFN-γ、IL-2 并无明显差异，考虑可能是因为本次研究所纳入的患者均为急性期HZ 患者，上述两个指标可能受到病情的影响，故并无显著差异。TNF-α 是机体对于肿瘤细胞进行杀伤炎性细胞因子，但在VZV 感染的患者中，反而会因为TNF-α 激活导致感染的神经局部炎性反应加重的情况发生，从而会导致患者发生疼痛等并发症，而其激活受到CD4+T 及CD8+T 细胞的影响［17］。

本研究PHN 发生率为26.56%，与共识当中的数据相符［6］。针对后续存在差异的指标进行分析：（1）两组患者合并前屈疼痛存在差异，主要是由于VZV 病毒多数潜伏于神经中，血液中分布较少，故检出率较低，往往等到后期出现皮疹以后才能明确HZ 诊断并对症治疗，但VZV 再发后疼痛发生的时间可能相对较早，病程相对较长，故发生PHN 的可能性也会增大；（2）开始治疗时间预示着病毒复制的时间，在未开始治疗期间，病毒复制控制相对更差，故此类患者局部病毒载量往往更高，清除相对难度更大，故PHN 发生率较高；（3）发病阶段指标差异也相对容易理解，由于发病节段多预示着神经损伤更严重，故后续发生PHN 概率也会增加；（4）TNF-α 是由PBMC 中的淋巴细胞介导所释放，且有研究［18］指出，TNF-α 相对集中于CD4+T 及CD8+T 细胞周围，故在PHN 患者PBMC 上清液中的TNF-α 含量也会相对升高。需要特别指出的是，针对外周血中的TNF-α 对比结果不存在差异，分析原因可能由于外周血中组成成分更多，且更复杂，会稀释TNF-α 的含量，从而外周血中的TNF-α 水平低于PBMC 上清液当中的TNF-α 水平，且两组之间比较并无显著差异。

随后的多因素分析结果再次说明了PBMC 上清液当中的TNF-α 水平是影响PHN 发病的独立因素，再次说明TNF-α 是影响PHN 发生的特异性细胞免疫因子，且对于PBMC 上清液当中的TNF-α 水平对于PHN 发生预测的ROC 结果进一步说明具有较好的预测效果，可以作为HZ 患者PHN 发生的预测因子之一。

本研究的局限性为，样本量相对较小，可能导致实验结果产生偏差，同时PMBC 提取相对复杂，对于临床实用性有限。结果提示TNF-α 是影响PHN 发生的VZV 特异性细胞免疫因子，故今后可以进一步增加样本量，同时开展多中心研究评估外周血TNF-α 水平与HZ 患者发生PHN 之间的关系，对本次研究进行补充，同时为临床治疗提供指导。

【Author contributions】YUAN Feng conceptualized，methodized and wrote original draft.FENG Dan supervised，wrote review and edited.LI Shaojun，ZHANG Shuli and LI Min investigated and validated the data.HU Han，TONG Shengxiong and TIAN Jiayu investigated and TIAN Jiayu investigated and contributed to formal analysis.All authors read and approved the final manuscript as submitted.