微RNA-194在宫颈癌中的表达及临床意义

崔桂荣，张金华，刘亚宁，李焱

在我国宫颈癌是一个威胁妇女健康最常见的恶性肿瘤之一，宫颈鳞癌是宫颈癌的主要病理类型［1-2］。近年来，由于宫颈癌筛查工作的广泛开展和以外科手术、放疗、化疗和靶向治疗等治疗技术提高，宫颈癌的临床预后有了很大的改善，但总体生存率仍有待进一步提高［3］。

微RNA（microRNA，miRNA）是一类能够调节基因表达的短单链内源非编码RNA（长约18～25个核苷酸），广泛存在于动物、植物、病毒等多种有机体中，miRNA可通过与互补的mRNA选择性地结合降解靶mRNA或抑制mRNA翻译，在转录后水平调控基因的表达［4］。miRNA通过调控细胞发育、增殖、分化、凋亡、信号转导、肿瘤发生和发展等基因的表达参与多种重要的生物学过程［5］。miRNA在各种恶性肿瘤中异常表达，其作用涉及原癌基因的激活与抑癌基因的失活，miRNA在宫颈癌的诊断和治疗中有重要作用［6］。研究发现miRNA-194在肺癌、喉癌、胃癌等实体瘤中异常表达［7-11］，大量研究证实miRNA-194与恶性肿瘤的侵袭和转移存在必然联系［12］，但是miRNA -194在宫颈癌中的作用目前仍未见明确的报道。

本研究通过回顾性收集宫颈癌组织以及癌旁组织样本，采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测上述样本中miRNA-194的表达情况，并分析miRNA-194的表达与临床病理因素的相关性，为研究miRNA-194在宫颈癌中的作用及其机制奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年5月至2016年1月于邯郸市第一医院行手术治疗的136例宫颈癌病人为研究对象。136例病人中采用分层抽样法选取58例宫颈癌病人的癌组织及相应癌旁正常组织，其余78例病人仅选取癌组织。癌旁组织取自手术切除残端，距离癌组织大于2 cm，切缘阴性，所取标本离体后置于液氮罐内迅速冷冻后置-80 ℃保存。纳入标准：年龄18～80岁；术前均经病理学检查确诊为宫颈鳞癌；术前未行化疗、放疗、激素治疗以及其他特殊治疗；行宫颈癌根治手术；术后病理确诊为宫颈鳞癌；病人临床诊疗及随访资料完整。排除标准：合并其他恶性肿瘤；合并严重妇科及心、脑、肾等严重内科疾病；随访资料不完整；随访期间因肿瘤以外因素死亡。136例病人年龄31～69岁，中位年龄为46岁；外生型91例，内生型45例；病理分级低、中和高分化分别为55例、43例和38例；2018国际妇产科联盟（FIGO）临床分期［13］：ⅠA期8例，ⅠB期9例，ⅡA期22例，ⅡB期18例，ⅢA期10例，ⅢB期6例，ⅢC期58例，ⅣA期5例；肿瘤长径（4.12±1.08）cm，范围为2.8～8.4 cm；淋巴结转移63例（ⅢC～ⅣA期），无淋巴结转移73例（ⅠA～ⅢB期）。本研究经邯郸市第一医院医学伦理委员会批准（批号201706F）。

1.2 主要试剂 Trizol总RNA提取试剂盒，逆转录酶试剂盒，荧光定量PCR sybrgreen试剂盒，Taqman small RNA Assays，DNA marker等主要试剂购于美国Invitrogen公司和Life Technologies公司。

1.3 qRT-PCR 采用qRT-PCR技术检测136例宫颈癌组织样本及58例癌旁组织样本中的miRNA-194相对表达量。参照说明中所述详细实验方法步骤，应用总RNA抽提试剂对上述样本进行总RNA的提取。用超微量分光光度计检测总RNA浓度和纯度。应用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为互补DNA（cDNA）。依照试剂盒说明书，配制反应液10 μL：总RNA 1 ng，根据总RNA浓度计算出所需体积、5 U/μL Poly A Polymerase 1 μL、RTase Mix 1 μL、5×PAP/RT Buffer 2.5 μL、双蒸水（RNase/Dnase free）补齐至总反应液为25 μL。控制反应条件为37 ℃60 min，85 ℃ 5 min。miRNA-194正向引物5'-CACGCATGTAACAGCAAC-3'，反向引物5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3'。所有反应均设置3个复孔，反应条件为95 ℃ 15 min、95 ℃ 10 s、58 ℃ 15 s、70 ℃ 30 s，共30个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，使用2-ΔΔCt法计算miRNA-194的相对表达量。根据miRNA-194的相对表达量的中位值对136例宫颈癌病人进行分组。

1.4 随访 本研究中所有病人的随访资料均保存完整，包括家庭地址和联系方式，随访方式为门诊、入院复查和电话随访，随访截止日期为2019年6月。观察终点为宫颈癌病人死亡，生存时间定义为术后病理确诊至因宫颈癌死亡的时间段。全组136例病人中，获得随访132例，失访4例。所有病人随访时间为2～72个月，中位随访时间为48个月，死亡49例。

1.5 统计学方法 应用SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以表示，采用t检验比较宫颈癌组织和癌旁组织间miRNA-194的表达差异；计数资料以例数表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用log-rank检验比较miRNA-194高低表达组间的生存差异。采用Cox风险回归对miRNA-194表达以及临床病理特征和病人总体生存率之间的关系进行分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-194在宫颈鳞癌组织中低表达 qRTPCR检测结果表明136例宫颈鳞癌病人癌组织miRNA-194的相对表达量（1.140±0.655）明显低于癌旁组织（4.502±1.168）（两独立样本t检验t=25.49，P＜0.001），其中58例宫颈鳞癌病人癌组织及其配对的癌旁组织miRNA-194的相对表达量分别为1.471±0.561和4.502±1.168（配对样本t检验t=17.82，P＜0.001）。

2.2 miRNA-194表达与临床病理特征的关系 本研究根据miRNA-194在宫颈癌组织中的相对表达中位数1.015将136例病人分为miRNA-194高、低表达组各68例。如表1所示，结果表明宫颈癌中miRNA-194相对表达水平与病人的年龄、大体类型、病理分级、浸润深度、淋巴结转移无关，与宫颈癌病人的FIGO分期和肿瘤长径相关，miRNA-194在宫颈癌高FIGO分期（P=0.001）和肿瘤长径大（P=0.033）的癌组织中相对表达水平较低。

表1 miRNA-194表达水平与宫颈癌病人临床病理特征的关系/例

2.3 miRNA-194低表达的宫颈癌病人生存期较短 Kaplan-Meier生存分析结果显示，miRNA-194高表达组病人3年和5年总生存率分别为87.8%和73.2%，低表达组宫颈癌病人的3年和5年总生存率分别为70.2%和51.6%，miRNA-194低表达组病人的生存期明显低于高表达组［HR95%CI=2.17（1.21，3.90），log-rankP=0.012］。Cox回归分析结果如表2所示，单因素分析表明FIGO临床分期、肿瘤长径、淋巴结转移情况和miRNA-194表达是影响136例宫颈癌病人生存预后的因素，进一步的多因素分析表明FIGO临床分期和miRNA-194表达是影响宫颈癌病人预后的独立因素。

表2 影响宫颈癌136例预后的Cox单因素和多因素分析

3 讨论

目前国内外大量研究证实miRNA-194充当抑癌基因作用于多种恶性肿瘤，在肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物过程中起关键作用［14-15］。然而，miRNA-194在宫颈癌中的作用尚不清楚。研究miRNA-194在宫颈癌中的表达、临床意义及与预后的相关性，对宫颈癌的诊断、判断预后及个体化靶向治疗具有重要意义。研究表明miRNA-194在非小细胞肺癌组织中低表达与病人生存期短显著相关，miRNA-194可通过靶向调节hNUDC基因抑制非小细胞肺癌细胞增殖，参与肺癌的发生发展［10，16］。近期，国内学者王纯斌等［17］的研究进一步证实了miRNA-194在非小细胞肺癌细胞中低表达，miRNA-194可抑制A549细胞的增殖和克隆形成能力，促进凋亡，其机制与调控JAK2/STAT3信号通路并促进活化的Caspase-3 蛋白表达有关。马一栋等［18］研究表明miRNA-194在肝癌细胞中的表达明显低于肝脏正常细胞，过表达miRNA-194可减慢肝癌细胞周期进程，抑制肝癌细胞生长，其机制可能与miRNA-194靶向调节甲基化转移酶DNMT3A相关。另外有学者研究表明胃癌病人血液中miRNA-194的表达水平明显低于健康人群，miRNA-194的表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴转移呈负相关，该研究提示miRNA-194可作为诊断胃癌的潜在生物标志物［19］。

本研究结果显示：miRNA-194在宫颈癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织，提示miRNA-194在宫颈癌组织中呈明显低表达，推测miRNA-194表达水平的下降与宫颈癌的发生、发展密切相关，随后探讨miRNA-194的表达与宫颈癌病人临床病理特征的关系，结果显示miRNA-194的表达与宫颈癌病人的FIGO分期和肿瘤长径具有密切关系，miRNA-194的表达与宫颈癌病人FIGO分期和肿瘤长径呈反比，提示 miRNA-194的表达与宫颈癌的进展密切相关；miRNA-194低表达者5年总生存率明显低于miRNA-194高表达者，且miRNA-194表达是宫颈癌病人独立预后因素，提示miRNA-194表达与宫颈癌预后密切相关，因此我们推测miRNA-194表达可作为一种新型宫颈癌预后和治疗靶点应用于临床。

Zhao等［11］通过收集165例经病理检查确诊的胃癌病人肿瘤组织及邻近健康组织，应用qRT-PCR检测胃癌组织中miRNA-194的表达水平显著低于邻近组织，miRNA-194在胃癌中的表达与TNM分期、癌细胞分化程度和淋巴结转移密切相关，体外实验表明过表达miRNA-194可显著抑制胃癌细胞的增殖和迁移。miRNA-194在喉部鳞状细胞癌中呈明显低表达，miRNA-194低表达喉癌病人的总生存时间和无进展生存时间明显低于miRNA-194高表达病人，miRNA-194表达与临床分期成反比关系［8］。此外，miRNA-194在膀胱癌、鼻咽癌、肾透明细胞癌、黑色素瘤等肿瘤中均有低表达，其表达水平的降低与预后不良密切相关，miRNA-194可通过一系列信号通路参与肿瘤生长和转移［7，20-22］。

miRNA-194在恶性肿瘤的化疗敏感性中也起到重要作用。miRNA-194可通过靶向Wee1在喉鳞状细胞癌中发挥抑癌作用，过表达miRNA-194可以抑制喉鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和耐药性［8］。过表达miRNA-194通过调节HMGA2抑制结直肠癌细胞的存活和上皮-间质转化，同时增加结直肠癌细胞对铂类和伊立替康治疗的敏感性［9］。miRNA-194通过抑制FOXA1调节非小细胞肺癌细胞对铂类化疗敏感性，miRNA-194在顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞系中表达下调，过表达miRNA-194可增加顺铂治疗的敏感性［12］。上述研究结果提示，miRNA-194抑制肿瘤细胞的增殖和转移，并可逆转肿瘤细胞对多种化疗药物的耐药。

综上所述，miRNA-194在宫颈癌中呈明显低表达，且与宫颈癌临床分期、肿瘤长径及预后密切相关，检测miRNA-194的表达可为宫颈癌的诊断和预后提供依据，其在宫颈癌进展中的具体作用机制值得进一步深入研究。