急性胰腺炎病人血清长链非编码RNA核富集转录体1、Toll样受体2表达变化及临床意义研究

刘会雪，牛立远，张佩佩，安江科，魏贯南

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）由多种因素导致胰酶的异常激活，引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死，以胰腺局部炎症反应为主要特征，是临床上常见的急腹症之一［1-2］。AP起病急、进展快，若不积极治疗，可能发展为重症AP，危及病人生命。目前有关AP发病机制尚不清楚，研究与AP发生发展有关的细胞因子，可能有助于临床AP发生的诊断和病情程度的评估，并采取措施以防止预后不良的发生。Toll样受体（Toll like receptors，TLR）是一种1型跨膜蛋白质，在先天性免疫系统中起重要作用，能够识别侵入体内的微生物，激活免疫细胞的应答，促进炎症反应的发生［3-4］。TLR2是TLR家族的重要组成，TLR2介导的免疫调节异常，可引起炎性因子的释放，导致机体免疫系统紊乱，进而导致免疫炎症性疾病的发生［5］。长链非编码RNA（long non coding RNA，LncRNA）广泛表达于真核生物体内，核富集转录体1（nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1）是一种未拼接的多腺苷酸化非编码转录本，研究表明LncRNA NEAT1参与TLR2介导的炎性因子的表达［6］。有关LncRNA NEAT1、TLR2在AP中的表达目前还少有研究，本研究通过检测AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平，探讨二者在AP病人中的表达变化及临床意义，以期为临床上AP的病情评估提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年5月至2020年12月石家庄平安医院收治的AP病人125例为AP组，男67例，女58例，年龄（49.16±10.83）岁，范围为26～71岁。根据疾病严重程度分为轻症AP（mild AP，MAP）56例、中重症AP（moderate and severe AP，MSAP）40例和重症AP（severe AP，SAP）29例。根据发病原因分为胆源性72例；非胆源性53例，其中高脂血症16例，乙醇性7例，医源性27例，原因不明3例。AP病人纳入标准：（1）符合《急性胰腺炎诊治指南（2014）》［7］中AP诊断标准；（2）发病24 h内入院；（3）影像学检查结果显示胰腺炎症改变。排除标准：（1）存在肺部感染、败血症等其他急性感染性疾病；（2）合并免疫性疾病病人；（3）合并心肝肾功能不全者；（4）合并恶性肿瘤病人。同期选取该院健康体检者130例为健康组，其中男71例，女59例，年龄（49.87±11.05）岁，范围为25～73岁，健康组与AP组年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）。研究经石家庄平安医院伦理委员会审核批准通过，伦理号：20170402。

根据急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ（acute physiology andchronic health evaluation，APACHEⅡ）对AP病人进行评分，并将病人分为轻症组（APACHEⅡ评分＜8分，即MAP）56例，重症组（APACHEⅡ评分≥8分，即MSAP和SAP）69例［8］。根据住院期间重症组AP病人预后情况，将病人分为预后不良25例，预后良好44例。

1.2 研究方法

1.2.1 试剂与仪器 总RNA提取试剂盒（DP433），天根生化科技（北京）有限公司；反转录试剂盒（205311）、实时荧光定量PCR试剂盒（208052），德国QIAGEN公司；TLR2酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（EH0300），武汉菲恩生物科技有限公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

实时荧光定量PCR仪（CFX96），美国BIO-RAD公司；超微量分光光度计（NanoDrop2000），酶标仪（Multiskan FC），美国Thermo Fisher公司。

1.2.2 血液采集 AP病人于入院24 h内，健康组于体检当日清晨采集空腹静脉血3 mL，3 000 r/min离心15 min，转移上清至新离心管中，-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测血清LncRNA NEAT1表达水平 RNA提取试剂盒提取血清中RNA，并检测RNA浓度。利用反转录试剂盒将RNA反转录为互补DNA（cDNA），之后进行qRT-PCR反应，反应条件为：95 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s；共40个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参基因，2-ΔΔCt法计算血清中LncRNA NEAT1的相对表达量。LncRNA NEAT1、GAPDH引物序列见表1。

表1 qRT-PCR检测血清LncRNA NEAT1表达水平引物序列

1.2.4 ELISA法检测血清TLR2水平 ELISA试剂盒检测血清TLR2水平，严格按照试剂盒说明书进行实验操作。

1.3 统计学方法 统计软件SPSS 25.0进行数据分析，计量资料以表示，两组间差异比较采用t检验；Pearson相关性分析探索AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平相关性及二者与病人APACHEⅡ评分的关系；受试者操作特性曲线（ROC曲线）分析血清LncRNA NEAT1、TLR2对AP病人病情程度的评估价值，曲线下面积（AUC）比较行Z检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康组与AP组血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比较 与健康组比较，AP组血清LncRNA NEAT1、TLR2水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 健康组与AP组血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比较/

表2 健康组与AP组血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比较/

注：LncRNA为长链非编码RNA，TLR2为Toll样受体2，AP为急性胰腺炎。

TLR2/（μg/L）0.59±0.24 6.43±1.05 61.76＜0.001组别健康组AP组t值P值例数130 125 LncRNA NEAT1 1.00±0.00 2.16±0.31 42.67＜0.001

2.2 不同严重程度AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比较 与轻症组比较，重症组AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 不同严重程度AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比较/

表3 不同严重程度AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比较/

注：LncRNA为长链非编码RNA，NEAT1为核富集转录体1，TLR2为Toll样受体2。

TLR2/（μg/L）5.86±0.92 6.89±1.16 5.40＜0.001 A例数56 69组别轻症组重症组t值P值LncRNA NEAT1 1.98±0.27 2.31±0.33 5.95＜0.001

2.3 不同预后重症AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比较 与预后良好组比较，预后不良组重症AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（表4）。

表4 不同预后重症AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比较/

表4 不同预后重症AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比较/

注：LncRNA为长链非编码RNA，NEAT1为核富集转录体1，TLR2为Toll样受体2。

TLR2/（μg/L）6.45±1.02 7.12±1.24 2.42 0.018组别预后良好组预后不良组t值P值例数44 25 LncRNA NEAT1 2.14±0.27 2.43±0.36 3.79＜0.001

2.4 AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平的相关性 AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2呈正相关（r=0.65，P＜0.001）（图1）。

图1 急性胰腺炎（AP）病人血清长链非编码RNA（LncRNA）核富集转录体1（NEAT1）、Toll样受体2（TLR2）水平的相关性

2.5 AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平与APACHEⅡ评分的关系 Pearson相关性分析结果表明，AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平与病人APACHEⅡ评分均呈正相关（r=0.50、0.52，均P＜0.001）。

2.6 血清LncRNA NEAT1、TLR2对AP病人重症的评估价值 ROC曲线结果显示，血清LncRNA NEAT1水平预测AP病人重症的AUC为0.73［95%CI：（0.64，0.82）］，灵敏度为68.1%，特异度为80.4%，截断值为2.17；TLR2预测AP病人重症的AUC为0.75［95%CI：（0.67，0.84）］，灵敏度为62.3%，特异度为83.9%，截断值为6.39 μg/L；血清LncRNA NEAT1联合TLR2水平预测AP病人重症的AUC为0.88［95%CI：（0.82，0.94）］，灵敏度为84.1%，特异度为71.4%。血清LncRNA NEAT1联合TLR2水平预测AP病人重症的AUC明显大于二者单独预测（Z=2.74、2.40，P=0.006、0.016）。

3 讨论

LncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，广泛参与机体表观遗传调控、细胞增殖、转录、转录后调控等多种生命活动［9］。LncRNA NEAT1是从位于人类第11号染色体上多发性内分泌瘤病I型的转录位点转录而来，主要在细胞核内表达［10］。LncRNA NEAT1被认为是人体组织中各种炎症反应的重要调节因子，参与免疫性疾病和炎症性疾病的发生发展有关［11-12］。金曌等［13］研究表明LncRNA NEAT1在银屑病病变皮肤组织中的表达显著高于正常组织，且与银屑病严重程度和炎性因子的表达量有关。He等［14］研究表明NEAT1与脓毒症的发病和严重程度有关，是脓毒症诊断和预后预测的生物标志物。Sheng等［15］研究槲皮素通过抑制LncRNA NEAT1的表达促进miR-216b抑制的雨蛙素诱导的小鼠AP。本研究表明AP病人血清LncRNA NEAT1表达显著高于健康组，且重症组AP病人显著高于轻症组病人，预后不良组显著高于预后良好组，提示LncRNA NEAT1与AP的发生发展及预后有关。临床上常用APACHEⅡ评分评估AP病人病情及预后，然而APACHEⅡ评分系统操作繁琐，因此寻找方便、快捷、且具有较高灵敏度和特异度的生物学标志物对AP病情评估具有重要意义。Pearson相关性分析显示血清LncRNA NEAT1水平与AP病人APACHEⅡ评分呈正相关，提示LncRNA NEAT1可能是评估AP病人病情的生物标志物。进一步ROC曲线分析表明血清LncRNA NEAT1对AP病人重症有一定的评估价值，截断值为2.17，提示当临床上检测LncRNA NEAT1水平超过2.17时，病人可能为重症AP，需密切关注病人情况，避免不良预后的发生。

AP发生过程中，细胞因子的过度释放会刺激各种炎症信号的激活和炎性因子的释放，导致炎症细胞的积聚和T细胞反应的减弱，这会引起腺泡细胞损伤，而胰腺星状细胞被激活为肌成纤维细胞样表型和胰腺损伤［16-17］。TLR是一种模式识别受体，通过感知和识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）激活免疫信号级联反应，PAMP是微生物高度保守的结构，TLRs在激活后发生二聚化，触发核因子κB（NF-κB）等信号通路的激活，诱导肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症细胞因子的产生；另一方面，TLRs的激活能够调节树突状细胞的成熟，诱导Th1和Th2细胞的增殖和分化［18］。TLR2是TLR家族重要一员，Ma等［19］研究表明TLR2与哮喘气道炎症的发生发展有关，敲除TLR2基因可能抑制NF-κB信号通路减轻哮喘小鼠模型气道炎症。本研究发现与健康组比较，AP病人血清TLR2水平显著升高，提示TLR2可能参与AP的发生，猜测可能与TLR2引起的炎症信号通路的激活和炎性因子的释放有关，具体机制有待进一步研究。研究还发现重症组病人血清TLR2水平显著高于轻症组，且与病人APACHEⅡ评分呈正相关，与预后良好组重症AP病人比较，预后不良组AP病人TLR2水平显著升高，提示TLR2水平与AP病人严重程度和预后有关。ROC曲线分析结果表明，TLR2对AP病人病情具有一定的评估价值，截断值为6.39 μg/L，提示临床上通过检测血清TLR2水平可能有助于AP疾病严重程度的判断，病人血清TLR2水平超过6.39 μg/L时，病人可能为AP重症，需密切关注病人，避免不良预后的发生。且通过绘制血清LncRNA NEAT1与TLR2联合的ROC曲线，结果发现二者联合的AUC更高，且能提高灵敏度，提示联合检测LncRNA NEAT1与TLR2对判断AP疾病严重程度可能更有意义。本研究还发现AP病人血清LncRNA NEAT1与TLR2水平呈正相关，LncRNA能够在转录和转录后水平调控基因表达从而参与机体多种生物学过程，Wang等［20］研究表明敲除LncRNA NEAT1可能通过抑制TLR2/NF-κB信号通路改善脂多糖（LPS）诱导的小鼠脓毒症心肌损伤，猜测LncRNA NEAT1可能与TLR2协同参与AP的发生发展，具体机制有待研究。

综上所述，AP病人血清LncRNA NEAT1与TLR2水平显著升高，且与AP病人严重程度有关，可能是临床上评估AP病人疾病严重程度的潜在生物标志物，LncRNA NEAT1与TLR2可能协同参与AP的发生发展。然而，本研究仅收集AP病人入院24 h内的血清标本进行分析，且仅从临床水平上检测了LncRNA NEAT1与TLR2在AP病人血清中的表达变化，下一步需收集更多时间点的血清标本，并结合基础实验，探讨二者在AP发生中的可能机制，可能为临床AP病情评估提供实验依据。