不同诱孢方法对辣椒疫霉菌孢子囊消长动态的影响

赵岩 祝文慧 赵晓军 殷辉 任璐 周建波

关键词：辣椒疫霉菌；最佳诱孢条件；抹伤处理；孢子囊产生；孢子囊释放

辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsicaLeonian）侵染辣椒植株引起的辣椒疫病是世界范围内普遍发生的一种毁灭性土传病害，是辣椒三大主要病害之一。该病害在辣椒整个生育期均会发生，在成株期危害最大[1]。该病害潜伏期短，蔓延速度快，传播范围广，常造成辣椒严重减产，甚至绝收[2-4]。辣椒疫病防治一直是辣椒生产的关键问题和难点问题[5]。辣椒疫霉菌属于霜霉目（Peronosporales）腐霉科（Pythiaceae）疫霉属（Phytophthora）[6-7]。无性阶段孢子囊是辣椒疫病田间再侵染的重要来源[8-9]，也是该病害相关研究的主要病原接种体[10]。获得足量辣椒疫霉菌孢子囊，能够为辣椒疫霉菌生物学特性、遗传分析及致病性等研究提供根本保证[11-12]。辣椒疫霉菌产生孢子囊的条件较为苛刻，在常规培养条件下不产生孢子囊或产孢子囊量较少[13]。目前，已有大量关于辣椒疫霉菌、致病疫霉菌等卵菌致病菌诱导孢子囊产生的培养环境条件、培养基筛选和培养菌体处理方法等方面的相关报道[14-17]，研究主要关注了不同诱孢方法对靶标菌最大产孢量的影响，但是不同诱孢方法对孢子囊消长动态影响的相关报道较少。

本研究将优化培养基和简化诱孢操作相结合，研究不同诱孢条件下辣椒疫霉菌孢子囊产生和释放变化动态，旨在明确其对辣椒疫霉菌孢子囊产生和释放的影响，为辣椒疫病的相关研究提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 辣椒疫霉菌BY1（Phytophthoracapsica），由山西农业大学植物保护学院植物病害研究室分离、纯化、鉴定和保存。

1.1.2 供试培养基 PDA培养基（土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH值7.0），OA培养基（燕麦30g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH值7.0），CA培养基（胡萝卜200g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH值7.0），V8培养基（V8汁100mL、碳酸钙0.02g、蒸馏水1000mL、pH值7.0），均在121℃条件下高压蒸汽灭菌20min[18]。

辣椒组织培养基（简称PA培养基）的配置方法为：取方椒果肉榨汁，过滤称取方椒汁200g，加入琼脂20g，用蒸馏水定容至1000mL，并将pH值调至7.0，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

1.2 试验方法

1.2.1 不同培养基对BY1菌落生长的影响 将活化后的供试菌株BY1沿菌落边缘打取5mm菌饼接种于供试培养基平板中央，置于25℃恒温培养箱培养，用十字交叉法测量菌落的最大扩展直径[19-20]。每个处理3次重复。

生长速度［20-21］=（菌落直径-5）/培养时间（1） 1.2.2 不同培养基对BY1产生和释放孢子囊的影响 将活化后的供试菌株BY1沿菌落边缘打取5mm菌饼分别接种于5种供试培养基平板中央，每种培养基接种60个皿，置于25℃恒温培养箱培养，待其菌落长满培养皿时，每间隔2d对3个培养皿进行一次镜检观察，并记录孢子囊总数和已完全释放了游动孢子的空孢子囊数目。每个处理3次重复。

孢子囊计数方法为：向培养皿中加入10mL无菌水，用消毒灭菌的毛刷刷洗菌丝表面，将孢子囊菌悬液倾倒至体积为10mL的试管内，摇匀吸取10μL孢子囊菌悬液于显微镜10倍视野下观察，统计孢子囊数量，然后根据孢子囊菌悬液的体积计算每毫升含有的孢子囊个数[22]。

1.2.3 抹伤处理对BY1产生和释放孢子囊的影响 将活化后的供试菌株BY1沿菌落边缘打取5mm菌饼分别接种于5种供试培养基平板中央，每种培养基接种60个皿，置于25℃恒温培养箱培养，待其菌落长满培养皿时，用灭菌涂布器进行菌丝抹伤处理，使所有菌丝贴于培养基平板上，继续置于25℃恒温培养箱内培养，每间隔2d对3个培养皿进行一次镜检观察，并记录孢子囊总数和已完全释放了游动孢子的空孢子囊数目，孢子囊计数方法同1.2.2。以相同培养基上未抹伤处理作为对照，每个处理3次重复。

1.3 数据分析

利用MicrosoftExcel2010进行试验数据平均值和标准差分析并绘制图表；利用SPSS26.0软件，采用Duncan′s新复极差法进行差异显著性分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对BY1菌落生长的影响

如图1所示，辣椒疫霉菌BY1在各供试培养基上生长速度有所差异，在OA培养基上生长最快，满皿时间为6d；在CA和PA培养基上生长速度次之，满皿时间为7d；在PDA培养基上满皿时间为8d；在V8培养基上生长最慢，满皿时间为9d。辣椒疫霉菌BY1在各供试培养基上生长速度均呈现先升高后降低的变化趋势（图2）。

2.2 不同培养基对BY1产生和释放孢子囊的影响

辣椒疫霉菌BY1在不同培养基上产孢子囊量的變化曲线如图3所示。

由图3可知，辣椒疫霉菌BY1在各供试培养基上孢子囊的产生时间、最大产孢量及续存期和孢子囊的释放时间均有所差异。待辣椒疫霉菌BY1在各供试培养基上长满皿后，在PA培养基上6d就可以观察到有孢子囊的产生，18d孢子囊量达到最大值，最大产孢续存期为8d；第26天孢子囊开始释放游动孢子；在第34天孢子囊完全释放，视野内全部为孢子囊空壳。在CA培养基上12d开始产生孢子囊，26d达到最大值，最大产孢续存期为6d；第32天孢子囊开始释放游动孢子；第38天完全释放。在V8培养基上18d开始产生孢子囊；第28天孢子囊产生量趋于稳定，最大产孢续存期为8d；第36天孢子囊开始释放游动孢子；第44天完全释放。在PDA和OA培养基上未观察到孢子囊的产生。

由图4可知，在5种供试培养基上，辣椒疫霉菌BY1在PA培养基上的最大产孢量显著高于其他培养基（P<0.05），最大产孢量为7.238万个/mL；CA培养基次之，最大产孢量为3.712万个/mL；V8培养基最大产孢量为0.523万个/mL。

2.3 抹伤处理对BY1产生和释放孢子囊的影响

从图5可以看出，辣椒疫霉菌BY1在各供试培养基上经过抹伤处理后，孢子囊的产生时间、最大产孢量及其续存期和孢子囊的释放时间均发生显著变化。在PA培养基上，抹伤处理后比未处理的培养基孢子囊产生时间提前了2d，最大产孢续存期增加了2d，孢子囊的释放时间增加4d；在CA培养基上，抹伤处理后培养基上的孢子囊产生时间提前了2d，最大产孢续存期增加了2d，孢子囊释放期延长了2d；在V8培养基上，抹伤处理后培养基的产孢时间比未处理时提前了4d，但是最大产孢续存期不变，孢子囊释放期缩短了2d；原本不产生孢子囊的OA培养基，抹伤处理后，在第24天观察到孢子囊的产生，第28天达到最大产孢量且续存期为4d，第34天孢子囊开始释放游动孢子，第40天孢子囊完全释放，视野内全部为孢子囊空壳；在PDA培养基上仍未观察到孢子囊的产生。

从图6可以看出，在5种供试培养基上，长满皿经过抹伤处理后，辣椒疫霉菌BY1在PA、CA和V8等3种培养基上的孢子囊产量显著高于对照（P<0.05）。其中，PA培养基抹伤处理后产生的孢子囊量显著高于其他诱孢处理（P<0.05），最大孢子囊产量为8.412万个/mL；在OA培养基上经过抹伤处理也开始产生孢子囊，但最大孢子囊产量仅有0.299万个/mL；PDA培养基上仍未产生孢子囊。

3 结论与讨论

本试验主要研究了不同培养基及抹伤处理对辣椒疫霉菌BY1孢子囊的产生和释放的影响，并将整个过程划分为菌落生长期（接种到菌落满皿）、孢子囊产生前期（菌落满皿到孢子囊开始产生）、孢子囊产生期（孢子囊开始产生到产孢量达到最大）、最大产孢续存期（保持最大产孢量的时期）、孢子囊释放期（孢子囊开始释放到完全释放）5个阶段。通过对各阶段动态变化过程的研究，可详细探究孢子囊发育周期及其影响因素，不再局限于用某一时间段或某一时刻的孢子囊数来衡量不同诱孢方法的产孢能力，如张荣等[23]将辣椒疫霉菌接种于5种培养基上，先置于26℃下暗培养3d，再连续光照培养6d后，随机取3点于10倍视野下镜检发现，在PSA和大豆瓊脂培养基上产生的孢子囊较多，分别为13.88、13.77个/视野；许亚池等[24]通过不同配比V8培养基、不同黑暗培养时间及无菌水处理，培养10d后于10倍显微镜下观察，探究对辣椒疫霉菌的产孢影响，结果发现，在5%V8培养基上，黑暗处理5d后加入适量无菌水，孢子囊最大产量为140个/视野。研究结果为以孢子囊为接菌体的相关试验提供了技术支撑，也为辣椒疫霉菌的生物学特性、遗传分析及致病性等与孢子囊相关的研究提供了理论支撑。

辣椒疫霉菌BY1在OA培养基上生长最快，接种后6d可满皿，但未观察到孢子囊产生，抹伤处理后满皿24d开始产孢，但产孢量较小；在PA培养基上接种后7d满皿，满皿后6d开始产孢，产孢量在5种供试培养基中最高。说明辣椒疫霉菌是否产生孢子囊、产孢开始时间及产孢量与菌落生长期长短无关，主要取决于孢子囊产生前期的长短，即菌丝体产生孢囊梗后再产生孢子囊的快慢。PA培养基大幅缩短了辣椒疫霉菌孢子囊产生前期的时间，促进了菌体产生孢子囊，提高了产孢能力。抹伤处理缩短了孢子囊产生前期和孢子产生期的时间，促进疫霉菌提前进入最大产孢阶段，同时也延长了最大产孢延续期和孢子释放期的时间。

陈方新等[25]研制了几种诱导苎麻疫霉（PhytophthoraboehmeriaeSawada）产生游动孢子囊的蔬菜汁混合培养液，其中，番茄与黄瓜按体积比1∶2的配比得到的培养液诱孢效果最佳，最大产孢量为0.314万个/mL；王拱辰等[26]从30种植物组织培养基中筛选出了3种能够促进镰孢属（Fusarium）李瑟组产生大孢子、小孢子和产孢细胞。这些研究证明了植物组织或植物组织培养基可诱导病原菌无性孢子产生。兰成忠等[27]通过果实创伤接种法将辣椒疫霉菌接种于黄瓜果实上，于28℃、24h光照培养4d后，黄瓜接种部位病斑迅速扩展，表面长出大量气生菌丝并产生大量的孢子囊，其产孢量为1.35万个/cm2，为辣椒疫霉菌寄主植物的植物体或组织培养液可以诱导孢子产生提供了理论依据。所以，本试验选取了辣椒组织培养基（PA）诱导辣椒疫霉菌孢子囊的产生，研究发现，PA培养基结合抹伤处理在接菌后11d开始产孢，21d达到最大产孢期，最大产孢持续期10d，最大产孢量可达8.412万个/mL，孢子囊释放期为12d，诱导孢子囊产生和延缓孢子囊释放作用均高于其他处理，且相比水淹法[23]等疫霉菌诱孢方法操作简单，可用于辣椒疫霉菌孢子囊的诱集。