牛乳铁素优势肽Lfcin B1-10 的生物信息学分析

宋成祺，于立权，崔玉东，

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院）

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）又称乳铁转运蛋白（Lactotransferrin，LTF），是一种分子量约为80 kDa 的铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族[1]。LF 广泛分布于人和哺乳动物乳汁、其他多种组织及其分泌液中，但乳汁中含量较高[2]，其中牛初乳中乳铁蛋白含量最高。血液中LF 主要由多形核细胞分泌，骨髓、唾液腺及子宫内膜等也能分泌少量乳铁蛋白[3]。LF 不仅对维持体内细胞铁水平发挥关键作用，同时还对多种病毒、细菌、真菌和寄生虫表现出强大的抗微生物活性，而且还具有抗炎和抗癌活性，也具有多种酶功能，是先天防御系统的关键组成成分[4]。

牛乳铁素（Bovine Lactoferricin，Lfcin B）是牛乳铁蛋白（Bovine Lactoferrin，LFB）在酸性条件下经胃蛋白酶水解后，从N 端释放产生的一种由25 个氨基酸残基组成的抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）[5-6]。Lfcin B 由牛乳铁蛋白（LFB）的第17～41 位氨基酸残基组成，序列为FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF，其中包括5 个色氨酸（Trp）、3 个赖氨酸（Lys）和多个芳香族氨基酸残基。序列中的2 个半胱氨酸（Cys）通过形成分子内二硫键使Lfcin B 形成不完全的环状结构[7]。Lfcin B 除不能结合铁离子外，其他功能则与LFB 基本一致，同样具有抗微生物、抗肿瘤、免疫调节以及抗氧化等多重生物学功能，它的抗菌活性甚至是LFB 的400 多倍[8]。Lfcin B 具有广谱抗菌作用（包括G+菌、G-菌和真菌），如金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）以及白色念珠菌（Canidia Albicans）等，但对肠道细菌的抑制作用具有选择性，而对肠道中的益生菌（如双歧杆菌、荧光假单胞菌以及乳酸菌等）的抑制效果较差或无抑制作用[8]；甚至，Lfcin B 在一定浓度范围内能够剂量依赖性地促进益生菌嗜酸乳杆菌的生长繁殖[9]。

对于Lfcin B 的抗菌机制，国内外研究学者普遍认为是Lfcin B 与细胞膜相互作用有关。原核细胞膜含有大量带负电的磷脂酰甘油，使细胞膜带有净负电荷，故带正电荷的Lfcin B 可与细胞膜表面的负电荷基团通过静电吸引相结合。研究表明，Lfcin B 氨基酸序列中的第4～9 位氨基酸残基（RRWQWR）是Lfcin B 发挥抗菌作用的活性中心[10-11]，其中，3 个精氨酸（Arg）残基侧链与细胞膜成分通过正负电荷吸引，而Trp 的芳香环结构与磷脂头部的甘油相互作用，通过疏水作用附着于外膜表面，利用疏水结构使Lfcin B 通过跨膜进入细胞，或者将多个Lfcin B 聚集到细胞膜上形成跨膜的离子通道，破坏了膜的完整性，使细胞膜通透性增强，导致细胞膜裂解，胞内容物外泄，最终死亡[8]。LfcinB 抗真菌的机制有两种，一种是对真菌的直接杀灭作用，Lfcin B 可与真菌细胞质膜发生相互作用，并影响其细胞质；另一种是通过提高宿主防御反应而实现的。来源于Lfcin B N 端区域的十肽（FKCRRWQWRM）可通过提高蛋白酪氨酸激酶（Protein-Tyr Kinase，PTK）活性和激活NADPH氧化酶复合体来诱导活性氧簇分子产生而提高多形核白细胞（polymorphocuclear leukocytes，PMNs）吞噬活性和对念珠菌属的杀菌作用[12]。

Ueta 等[12]将Lfcin B 氨基酸序列的第11～25 位氨基酸残基去除，得到第1～10 位氨基酸残基构成的寡肽，命名为Lfcin B1-10，其序列为FKCRRWQWRM，并证明具有良好的抗菌和激活嗜中性粒细胞活性。但作为一种来源于Lfcin B 的新型小分子抗菌肽，对Lfcin B1-10的理化性质、二级结构以及跨膜区等尚不清楚，进而影响了对Lfcin B1-10的构效关系及抗菌机制的认识。因此，研究利用在线生物信息学工具对Lfcin B1-10的氨基酸组成、理化性质、二级结构、跨膜区、信号肽及酶切位点等特征进行了分析，同时与Lfcin B 进行比较、预测，为Lfcin B1-10的深入研究及其构效关系、抗菌作用机制和实际应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以牛乳铁素Lfcin B1-10为研究对象，氨基酸序列为FKCRRWQWRM；以牛乳铁素（Lfcin B）作为参照，其氨基酸序列为FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF。

1.2 方法

利用在线生物信息学分析工具对牛乳铁素Lfcin B1-10及牛乳铁素（Lfcin B）的氨基酸组成、理化性质、二级结构、跨膜区、信号肽及酶切位点等特征进行分析，所用分析工具如表1 所示。

表1 用于生物信息学分析的工具Table 1 Software for bioinformatic analysis

2 结果与分析

2.1 氨基酸组成

Lfcin B1-10含有10 个氨基酸残基，由7 种基本氨基酸组成；Lfcin B 含有25 个氨基酸残基，由15 种基本氨基酸组成。Lfcin B1-10与Lfcin B 所含氨基酸残基数目和占比如表2 所示。

表2 Lfcin B1-10 和Lfcin B 的氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of Lfcin B1-10 and Lfcin B

结果显示，Lfcin B1-10包含1 个极微残基（C）、1个小侧链残基（C）、3 个芳香族残基（F+W）、5 个非极性（疏水性）残基（F+C+W+M）、5 个极性（亲水性）残基（K+R+Q）以及4 个带正电荷（碱性）残基（K+R，占残基总数的40%），不含脂肪族残基和带负电荷（酸性）残基；Lfcin B 则包含7 个极微残基（C+G+A+S+T）、9 个小侧链残基（C+G+A+P+S+T+V）、3 个脂肪族残基（L+I+V）、4 个芳香族残基（F+W）、14 个非极性（疏水性）残基（F+C+W+M+L+G+A+P+I+V）、11 个极性（亲水性）残基（K+R+Q+S+T）以及8 个带正电荷（碱性）残基（K+R，占残基总数的32%），同样也不含带负电荷（酸性）残基。

以上结果可以看出，Lfcin B1-10的热稳定性要低于Lfcin B（前者无脂肪族残基，而后者含有3 个），更易于降解，这提示其在相对高温的环境中（如机体内）的抗菌作用可能弱于Lfcin B。因Lfcin B1-10的极性与非极性残基数相等（各占残基总数的50%），而Lfcin B 的极性残基数少于非极性（分别占残基总数的44%和56%），故推测其疏水性弱于Lfcin B。AMPs的抗菌活性与其所含正电荷数密切相关，一般认为正电荷数越高则抗菌活性越强，而Lfcin B1-10的正电荷残基数仅为Lfcin B 的1/2，且二者均无负电荷残基，这表明Lfcin B1-10的抗菌活性可能弱于Lfcin B。

2.2 理化性质

经ProtParam 分析，Lfcin B1-10及Lfcin B 的分子式、相对分子质量、等电点、带电荷氨基酸数目、半衰期、稳定性、脂溶性及亲水性等理化性质如表3 所示。

表3 Lfcin B1-10 及Lfcin B 的理化性质Table 3 Physicochemical properties of Lfcin B1-10and Lfcin B

结果显示，Lfcin B1-10的理论等电点与Lfcin B 基本相同，且均大于11，这可能是它们只含碱性氨基酸，而不含酸性氨基酸的原因。Lfcin B1-10与Lfcin B均可被紫外分光光度计（280 nm）检测。Lfcin B1-10的不稳定指数达到了108.53，Lfcin B 的不稳定指数则为77.92，表明二者均属于不稳定多肽，且相较于Lfcin B，Lfcin B1-10则更不稳定；同时，Lfcin B1-10的脂肪族指数为0.00，Lfcin B 的脂肪族指数为50.80，表明二者热稳定性均较差，且Lfcin B1-10次于Lfcin B，这与氨基酸组成分析的结果一致，预示其在实际应用中有一定局限性；亲水性平均系数反映多肽的亲水性强弱，其值范围在-2～2 之间，负值越大表示亲水性越强，正值越大表示疏水性越强，Lfcin B1-10和Lfcin B 的亲水性平均系数分别为-1.550 和-0.576。虽然Lfcin B1-10的疏水性残基数与亲水性残基数相等，且Lfcin B 的疏水性残基数还大于亲水性残基数，但分析结果却表明Lfcin B1-10和Lfcin B 均为亲水性多肽，且Lfcin B1-10的亲水性强于Lfcin B，推测这可能与氨基酸残基的排列顺序有关。同时，这也应证了氨基酸组成分析的结果。

以上结果表明，Lfcin B1-10和Lfcin B 均为不稳定的、亲水性的阳离子型（Lfcin B1-10的净电荷数为+4，Lfcin B 的净电荷数为+8）小分子抗菌肽。

2.3 二级结构

如图1 所示，经SOPMA 分析（运行参数：视窗宽度为17，相似度阈值为8，构象状态数目为4），Lfcin B1-10的二级结构仅有无规则卷曲（10 个氨基酸残基均参与），表明无规则卷曲可能是Lfcin B1-10发挥抗菌作用的结构基础；Lfcin B 的二级结构较Lfcin B1-10复杂，主要为α 螺旋。其中，α 螺旋占44.00%（11 个氨基酸残基参与），延伸链占16.00%（4 个氨基酸残基参与），β 转角占20.00%（5 个氨基酸残基参与），无规则卷曲占20.00%（5 个氨基酸残基参与），推测α 螺旋可能是其发挥抗菌作用的重要结构基础。

图1 Lfcin B1-10 及Lfcin B 的二级结构预测Fig.1 Secondary structure prediction of Lfcin B1-10 and Lfcin B

2.4 跨膜区

跨膜区（transmembrane domain，TMD）是跨膜蛋白的疏水性氨基酸（跨越膜两侧）区域，通常为α 螺旋结构。Lfcin B1-10及Lfcin B 均来源于LFB，而LFB并非跨膜蛋白，理论上不存在跨膜区，但Lfcin B1-10及Lfcin B 的杀菌作用又与使病原菌细胞膜裂解现象密切相关，为了探究其杀菌机制是否与跨膜作用有关，使用分析工具TMHMM-2.0 对Lfcin B1-10、Lfcin B 及LFB 的跨膜区存在与否进行预测分析，结果显示，LFB 全序列均不存在跨膜区，这表明Lfcin B1-10及Lfcin B 的杀菌机制与跨膜作用无关，推测Lfcin B1-10和Lfcin B 在与病原菌作用过程中，首先通过静电相互作用吸附、聚集在病原菌表面，然后其疏水氨基酸通过疏水作用插入磷脂双分子层中，最终导致病原菌细胞膜通透性增加，直至裂解死亡。

2.5 信号肽

信号肽（signal peptides，SPs）是一种引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的疏水性氨基酸序列（有时不一定在N 端）。经SignalP-6.0 预测分析的结果显示，LFB 的第1～22 位氨基酸中可能存在信号肽，而Lfcin B1-10与Lfcin B的氨基酸序列中均不含信号肽。

有研究认为，AMPs 的无规则卷曲结构除了作用于病原菌胞膜，改变胞膜的通透性外，还有助于在病原菌胞膜上形成孔洞，然后进入病原菌细胞，与胞内核苷酸或酶作用，干扰其正常代谢，最终抑制或杀死病原菌，这也与研究学者普遍认同的Lfcin B 的抗菌机制类似。但研究结果表明，Lfcin B1-10和Lfcin B 均无信号肽，这表明其自身并不能实现跨膜转移，理论上无法进入病原菌胞内，故其杀菌机制可能并非与穿膜作用有关。

2.6 酶切位点

如表4 所示，经Peptide Culter 分析，Lfcin B1-10和Lfcin B 可同被11 种蛋白酶剪切。

对于Lfcin B1-10，Arg-C 蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（高特异性）、糜蛋白酶（低特异性）、梭菌蛋白酶、蛋白酶K 和胰蛋白酶均有多个剪切位点（≥3），胃蛋白酶（pH＞2）有2 个剪切位点，LysC、LysN、胃蛋白酶（pH 1.3）和嗜热菌蛋白酶仅有1 个剪切位点；对于Lfcin B，胃蛋白酶（pH 1.3）有2 个剪切位点，而除胃蛋白酶（pH 1.3）外，其余10 种酶均有多个剪切位点（≥3）。同时，Lfcin B1-10序列中仅第3 和第7 位氨基酸残基为非酶切位点。而Lfcin B 序列中也仅第3、7、14 和16 位氨基酸残基为非酶切位点。同时，Lfcin B的酶切位点包含了Lfcin B1-10的所有位点。此外，二者均存在同一位点可被多种酶剪切的特点。

稳定性是衡量AMPs 能否投入实际生产应用的重要指标，而以上结果表明，Lfcin B1-10和Lfcin B 在机体内均易降解，预示它们在机体内的环境稳定性较差，这也与ProtParam 分析的理化性质结果一致。这虽不利于Lfcin B1-10和Lfcin B 的生物表达与开发应用，但通过蛋白酶的酶解作用有助于Lfcin B1-10和Lfcin B 被降解转化为易被机体吸收利用的小分子氨基酸类物质。因此，Lfcin B1-10和Lfcin B 不仅具有良好的生物安全性，同时还有一定的营养价值。

3 讨论

1992 年，Bellamy 等[6，13]首次发现LFB 的抗菌结构域的一级结构对应于其氨基酸序列N-末端的第17～41 位残基，他们从LFB 的胃蛋白酶体外酶解物中分离得到这段序列，并将其命名为Lfcin B。而Lfcin B1-10则是通过顺序去除Lfcin B 氨基酸序列的C-末端残基来设计的，其保留了Lfcin B 中具有抗菌活性的最小基序RRWQWR，即Lfcin B 氨基酸序列中发挥抗菌作用的优势片段[14-16]。Lfcin B1-10的生物学功能与其结构有关，通过对Lfcin B1-10的生物信息学分析，可以为进一步探究其构效关系与抗菌机制提供参考。

有研究表明，疏水性氨基酸有助于AMPs 选择性靶向病原菌胞膜，从而抑制或杀灭病原菌[17]。国内外对Lfcin B 抗菌活性作用机制的普遍观点认为，Lfcin B 靠其本身所带有的正电荷与G+菌细胞膜上的磷壁酸或G-菌细胞膜上的脂多糖产生静电相互吸引，使Lfcin B 附着于膜的表面，然后靠其疏水氨基酸造成细胞膜结构的改变，并进一步引发形成离子通道，或直接插入细胞膜使膜裂解，导致胞内容物外泻，使细菌死亡[18]。故Lfcin B1-10和Lfcin B 的疏水性残基可能在一定程度上增强了它们的抗菌活性。

一般来说，阳离子型AMPs 的抗菌活性较强，且通常带有2～9 个正电荷氨基酸残基（主要为赖氨酸、精氨酸和组氨酸等）。研究结果显示，Lfcin B1-10和Lfcin B 的氨基酸序列中分别含有4 和8 个正电荷残基（K+R），无负电荷氨基酸，净电荷数分别为+4 和+8，说明二者均为强阳离子型AMPs，这可能是它们发挥抗菌作用的重要基础[19]。同时，Lfcin B1-10的净正电荷数仅为Lfcin B 的1/2，推测Lfcin B 的抗菌作用可能强于Lfcin B1-10。但有研究表明，Lfcin B 拥有最强抗菌活性时所需的最低净正电荷为+4[20]，故理论上Lfcin B1-10本身即可发挥与Lfcin B 达到最强抗菌活性时同等的抗菌作用。

研究表明，Lfcin B 并不会使病原菌细胞膜裂解，但能够穿透细菌细胞质膜，由于细胞质内含有大量多聚阴离子，这些多聚阴离子可作为Lfcin B的作用位点，从而使细胞质内脂质体融合[21]。也有研究发现核苷酸可能是Lfcin B 在细胞内的潜在靶点之，Lfcin B 可以穿透核膜[22]。一般认为，蛋白若形成跨膜通道需要包含至少18 个氨基酸残基[23]。但本研究对Lfcin B1-10和Lfcin B 的跨膜区及信号肽的预测分析结果显示，无论是仅含有10 个氨基酸残基的Lfcin B1-10还是含有25 个氨基酸残基的Lfcin B，均不存在跨膜区和信号肽，表明Lfcin B1-10和Lfcin B的抗菌作用机制似乎与跨膜作用及穿膜作用均无关，其具体的抗菌作用机制较为复杂，有待进一步研究。通过对Lfcin B1-10和Lfcin B 的酶切位点分析发现，两种多肽可被多种蛋白酶酶解，在机体内稳定性较差。

4 结论

利用生物信息学方法对牛乳铁素Lfcin B1-10和Lfcin B 进行了比较分析。研究发现二者均为不稳定的强阳离子型亲水性抗菌肽，均没有跨膜区和信号肽，均可被机体内多种酶降解，生物安全性较高。与Lfcin B 相比，Lfcin B1-10保留了Lfcin B 的最大抗菌活性，二级结构仅含有无规卷曲，较为简单。为进一步研究牛乳铁素Lfcin B1-10的构效关系、抗菌机制提供了理论参考，也为发现和临床开发牛乳铁素衍生抗菌肽提供了有价值的实际应用信息。