基于网络药理学及分子对接探讨马齿苋治疗腹泻型肠易激综合征靶点分析

杨阳，曹俊阳，周协琛，李涛，李炎，赵蕊

（黑龙江八一农垦大学，大庆 163319）

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一中常见的功能性胃肠道疾病，其临床特征为慢性间歇性腹痛并伴有排便习惯改变或排便性状的改变[1]。根据罗马Ⅲ标准以及患者疼痛部位、粪便稠度的不同，IBS 主要分为腹泻型肠易激综合征（IBS with diarrhea，IBS-D）、便秘型肠易激综合征（IBS with constipation，IBS-C）、腹泻和便秘交替型肠易激综合征（IBS with mixed symptomology，IBS-M）及未分类型肠易激综合征（IBS-unclassified）四种亚型[2]。IBS-D 作为IBS 的主要亚型，占据IBS 病例的23.3%～65%[3]。IBS-D 在中、青年中多见，但近年来IBS-D 老年患者数量也在攀升。反复发作的IBS-D 可诱发多种慢性疾病，并严重影响患者情绪健康和生理功能，对生活质量产生负面影响。

中医有“无湿不成泄”之说。历代医者多认为IBS-D 的病发主要与湿热、肝郁、脾泻相关。马齿苋（Portulaca oleracea Linn，POL）形似马齿，全草可入药，由清热祛湿、健脾止泻、凉血止血之功[4]。作为一种传统治疗肠炎及腹泻的中药材，马齿苋早在北宋时期就已被发现并得到运用。《圣惠方》曾应用马齿苋煮粥以治血痢，马齿苋治红痢症也早记载于《生草药性备要》中[5]。现代医学研究表明，马齿苋可通过抑制肠粘膜的氧化应激及肠上皮细胞的凋亡发挥对肠道的保护作用[6-7]。马齿苋因其富含黄酮、有机酸、多糖等多种抗菌成分而被誉为“天然抗生素”[8-10]。现代药理学研究表明马齿苋具有抗氧化、抗肿瘤、调节血糖等生物学功能[11-13]。目前，马齿苋已成为治疗急、慢性细菌性痢疾的要药，但其治疗IBS-D 的作用机制研究还不深入。

网络药理学是一个融合了生物学、药学、数学和计算机科学的新兴学科。因为集目标化合物筛选、多靶点预测、网络构建于一体，网络药理学已成为探究中药潜在活性成分及防治疾病作用机制的综合工具[14]。研究以马齿苋为对象，通过网络药理学手段探究马齿苋治疗IBS-D 潜在的作用机制，为马齿苋治疗IBS-D 提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 马齿苋化学成分的收集与筛选

利用中药系统药理学分析平台TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索中草药马齿苋的有效化学成分。设置口服利用度（OBioaval，OB）和类药性（drug-likeness，DL）为筛选条件。以“马齿苋”为关键词，筛选出OB≥30%及DL≥0.18 的化学成分即为马齿苋的有效成分。

1.2 IBS-D 靶点的收集与筛选

以“Diarrhea irritable bowel syndrome”“Diarrheairritable bowel syndrome”“D -irritable bowel syndrome”“irritable bowel syndrome-Diarrhea”“irritable bowel syndrome-D”“IBS-D”“D-IBS”为关键词在GeneCard 数据库（https：//www.genecards.org/）中查找腹泻型肠易激综合征的相关靶点，汇总并删除重复靶点。以IBS 为关键词在CTD 数据库中查找肠易激综合征相关的靶点。CTD 数据库与GeneCard 数据库的交集靶点即为IBS-D 对应的疾病靶点。

1.3 马齿苋治疗IBS-D 靶点互作用网络的构建

借助Venny 分析工具（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html）获取马齿苋与IBS-D 的交集靶点。将交集靶点蛋白导入STRING（https：//string-db.org/）数据库，在参数栏中设定置信分数高于0.9，去掉游离节点后导出PPI（Protein-protein interaction，PPI）蛋白互作网络图。将网络导入Cytoscape 3.7.2，根据度值对网络进行拓扑学分析并利用cytoscape 中cytohubba 插件筛选核心治疗靶点，根据筛选结果绘制POL 治疗IBS-D 核心靶点的PPI 网络图。

1.4 GO 富集分析

利用DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对核心靶点进行基因本体（Gene ontology，GO）富集分析。将核心靶点导入DAVID 数据库，设置物种为“Homo sapiens”，运行并保留核心靶点生物学过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cellular Component，CC）及分子功能（Molecular Function，MF）三方面的分析结果。将分析结果上传至Bioinformatics 平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/），以基因数为纵坐标绘制BP、CC、MF 三合一条形图。

1.5 KEGG 富集分析

使用Cytoscape 中的clueGO 插件对核心靶点进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析。上传马齿苋治疗IBS-D 的核心靶点，将物种设为“Homo sapiens”，以p-value＜0.01 为筛选条件进行KEGG 富集分析并利用CluePedia 插件调整ClueGO分析网络图。

1.6 分子对接

在TCMSP 数据库下载马齿苋活性成分mol2 格式的结构。从PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）获取核心蛋白的3D 结构。利用分子对接软件AMDock 计算分子对接的结合能并借助Pymol 软件将对接结果可视化。

2 结果与分析

2.1 马齿苋活性化合物筛选

以OB≥30%、DL≥0.18 为条件在TCMSP 数据库对马齿苋活性成分进行筛选。如表1 所示，筛选后共得到10 个马齿苋活性化合物，包括花生四烯酸（Arachidonicacid）、环阿乔醇（Cycloartenol）、β-胡萝卜素（Beta-carotene）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol）、山柰酚（Kaempfero）、木犀草素（Luteolin）、异甜菜素（Isobetanidin）、脱糖苷异豆素（Isobetanin_qt）、槲皮素（Quercetin）等。马齿苋活性化合物对应化学结构见图1。

2.2 IBS-D 疾病靶点获取

如图2 所示，从GeneCard 数据库中共搜集到IBS-D 相关靶点2 344 个，从CTD 数据库中共搜集到IBS 相关靶点464 个。将GeneCard 数据库与CTD数据库的靶点取交集，共得到222 个IBS-D 疾病靶点。

图2 马齿苋与IBS-D 交集靶点韦恩图Fig.2 Venn Diagram of intersection target of POL and IBS-D

2.3 马齿苋治疗IBS-D 的潜在靶点

通过TCMSP 数据库获取马齿苋的靶点，并利用UniProt 数据库（https：//www.Uniprot.org/）将马齿苋靶点名称标准化。利用韦恩图分析工具对马齿苋靶点与IBS-D 靶点取交集。如图2 所示，马齿苋活性成分靶点共194 个，其中与IBS-D 相关的有68 个，包括IL10、MAPK8、VEGFA 等。

2.4 马齿苋治疗IBS-D 潜在靶点PPI 网络分析

将马齿苋治疗IBS-D 的68 个潜在靶点导入String 数据库进行分析。如图3 所示，PPI 网络由68个节点和219 条边构成，其中有6 个靶点与其他靶点无交集。将互作网络导入Cytoscape 软件，删除无交集靶点后依据度值对剩余靶点进行排序。度值越高的靶点表示与该靶点相互作用的蛋白数量越多。由图4 可知，JUN、RELA、IL6、TNF、IL10 度值较高，在网络中起主导作用。

图3 马齿苋治疗IBS-D 潜在靶点PPI 网络图Fig.3 PPI network of potential target of POL in the treatment of IBS-D

图4 潜在靶点蛋白互作拓扑学分析图Fig.4 Topology analysis results of potential targets interaction

2.5 马齿苋治疗IBS-D 核心靶点PPI 网络分析

利用Cytoscape 软件中CyoHubba 插件进行网络拓扑分析，获取马齿苋治疗IBS-D 的核心靶点。如图5 所示，马齿苋治疗IBS-D 的核心靶点包括白细胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素-8（Interleukin-8，CXCL8/IL-8）、单核细胞趋化蛋白1（Monocyte chemotactic protein-1，CCL2/MCP-1）、白细胞介素-1B（Interleukin-1B，IL-1B）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1A（Interleukin-1A，IL-1A）、白细胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）、核转录因子（NF-κB p65，RELA）等。

图5 马齿苋治疗IBS-D 核心靶点PPI 网络图Fig.5 PPI network of POL core target in the treatment of IBS-D

2.6 马齿苋治疗IBS-D 核心靶点GO 富集分析

GO 富集分析涵盖BP、CC、MF 三方面。设定阈值为P＜0.05，在此条件下共获取123 个GO 条目，其中BP 111 个，CC 4 个，MF 8 个。如图6 所示，前10 条BP 涉及炎症反应、免疫应答、转录的正调控、细胞对脂多糖的反应、细胞因子介导的信号通路、衰老及对药物的反应等。CC 分析结果表明这些靶蛋白多分布在细胞外间隙、胞外区及质膜外侧上。MF 分析结果表明：这些靶蛋白的分子功能主要为细胞因子活性、生长因子活性、趋化因子活性等。

图6 GO 富集分析结果Fig.6 Analysis results of GO enrichment

2.7 马齿苋治疗IBS-D 核心靶点KEGG 富集分析

利用Cytoscape 软件中ClueGO 插件对马齿苋治疗IBS-D 的核心靶点进行KEGG 富集分析。以P＜0.01 为条件进行筛选，共筛选出40 条POL-IBS-D潜在信号通路。ClueGO 网络图中每一个节点代表一个term，同种颜色则表示相近的term 聚类。由图7 所示，马齿苋治疗IBS-D 的机制主要涉及NOD 样受体信号通路（NOD-like receptors signaling pathway）、NF-κB 信号通路（Nuclear factor-kappa B signaling pathway）、白细胞介素-17 信号通路（Interleukin-17 signaling pathway）等。这些信号通路与细胞因子-细胞因子受体的作用、造血细胞系、产IgA 的肠道免疫网络调控等密切相关。此外，这些信号通路也参与了脂质动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、炎症性肠病、哮喘等疾病。

图7 KEGG 信号通路富集分析结果Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis results

2.8 分子对接结果

将马齿苋活性化合物分别与RELA、CCL2、CXCL8、IL-1A 等核心靶点蛋白进行分子对接验证。对接得分越小，表明受体蛋白与配体分子结合的越稳定。如表2 所示，马齿苋活性化合物与大部分核心靶点均有较好的结合。其中，花生四烯酸与IL-1A蛋白结合较好；环阿乔醇和β-胡萝卜素与RELA蛋白结合效果较好；β-谷甾醇与TNF 蛋白结合较好；山奈酚、橙皮苷、木犀草素及槲皮素均与JUN 蛋白结合较好，异甜菜素及脱糖苷异豆素与IL-10 蛋白结合较好，这表明IL-1A、RELA、TNF、JUN 及IL-10 可能是马齿苋治疗IBS-D 的关键靶点。将对接结果用Pymol 进行可视化分析并绘制分子对接模式图。由图8 可知，马齿苋活性化合物多通过氢键作用力与核心蛋白氨基酸残基发生相互作并结合至蛋白活性位点。

图8 分子对接模式图Fig.8 Molecular docking diagram

表2 核心靶点与马齿苋化合物的分子对接结果Table 2 Molecular docking results of core active ingredients of POL

3 讨论

IBS-D 是一种慢性复发性胃肠道疾病，发病机制尚未明确。国外有学者指出，IBS-D 常见于细菌性胃肠炎症后，并多伴随肠粘膜持续的免疫激活[15]。目前，治疗IBS-D 的药物主要包括止痛类药物及止泻类药物，如硝苯吡啶、苯乙哌啶等，但这些药物均存在一定的毒副作用，不适宜长期服用。传统中药因其高效低毒的特性而被广泛应用于治疗多种疾病[16]。马齿苋是一种民间传统中草药，多用于治疗腹泻、腹痛等症。然而，马齿苋的活性成分及其治疗IBS-D 的作用机制目前仍不清楚。在研究中，利用网络药理学手段筛选了马齿苋的活性成分并探究了马齿苋治疗IBSD 的分子靶点和机制。

通过TCSMP 数据库检索马齿苋的成分并以类药性及口服利用度为条件进行筛选，最终得出10 种马齿苋主要活性成分，包括β-胡萝卜素、橙皮苷、山柰酚、木犀草素、槲皮素等。作为维生素A 的前体，β-胡萝卜素具有明显的自由基清除特性。临床研究表明，服用β-胡萝卜素可以缓解IBS-D 的炎症状态，改善IBS-D 患者的腹痛强度和排便频率[17]。Yosuke等[18]研究发现，20 mg·kg-1木犀草素可以保护葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎并显著抑制巨噬细胞和CD4T 细胞向结肠粘膜的浸润，说明木犀草素具有肠道抗炎活性。此外，槲皮素、橙皮苷、山柰酚等成分也可通过抑制氧化应激、调节肠粘膜功能、平衡肠道微生物等途径维持肠道稳态[19-20]。以上结果表明，这些成分可以作为马齿苋的活性成分并进行后续抗IBSD 相关机制的探究。

基于马齿苋活性化合物筛选得到与IBS-D 相关靶点共68 个。对68 个靶点进行蛋白互作网络分析后发现，JUN、RELA、TNF、IL-10、IL-1B、IL-1A 等靶点度值较高，与其他靶点相互作用较为密切，为马齿苋治疗IBS-D 的核心靶点。富集分析结果表明核心靶点参与的生物学过程主要与炎症反应、免疫应答、衰老、细胞增殖以及细胞因子的调节相关。有研究表明，肠粘膜持续的低度炎症可能是IBS-D 发病的重要原因[21]。在马齿苋调节IBS-D 的核心靶点中，与调节炎症反应相关的靶点蛋白数量占据80%，主要包括IL-1A、IL-1B、TNF、CXCL8、RELA、IL-10 等。IL-1A 和IL-1B 是IL-1 家族的重要成员。作为有效的炎症细胞因子，IL-1A 和IL-1B 可激活炎症过程并引发局部和全身炎症反应[22]。然而与健康人群相比，IBSD 患者体内IL-1A、IL-1B 水平显著升高。肠内稳态的紊乱被证明是IBS-D 患者肠道炎症的基础。作为一种强大的炎症诱导剂，TNF 可通过破坏紧密连接蛋白、诱导上皮细胞分泌炎性因子、激活NF-κB 等方式广泛参与细胞分化、凋亡并诱发炎症反应[23]。有研究表明，小檗碱能够下调IBS-D 小鼠模型中TNF-α/NF-κB/MLCK 通路的异常激活，从而保护肠上皮紧密连接并修复IBS-D 对肠上皮屏障造成的损伤[24]。Chu Hao-Ran 等[25]在探究艾灸对IBS-D 大鼠结肠TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路的影响时也发现，艾灸治疗后血清中的TNF-α 水平显著降低，炎症情况明显缓解。此外，从富集分析结果中可知，大部分核心靶点也与衰老密切相关。由此可见，马齿苋可通过作用于炎症相关靶点并抑制衰老相关基因表达从而对ISB-D 老年患者起到保护作用。

KEGG 通路分析结果显示马齿苋治疗IBS-D 的关键通路主要包括NOD 样受体信号通路、NF-κB 信号通路、白细胞介素-17 信号通路、TNF 信号通路、TLR 信号通路等。目前，已知宿主NOD 样受体蛋白6（NOD-like receptor family pyrin domain containing 6，NLRP6）炎症信号通路与IBS 密切相关。有研究结果表明，温和灸可以通过控制NLRP6 炎性体信号传导来缓解IBS 的炎症和内脏超敏反应[26]。NF-κB 由一系列转录因子组成，可参与调节炎症、先天免疫等多种生物反应。通泻药方已被证明对IBS-D 患者有效。研究表明，通泻药方可增强肠黏膜屏障功能，其机制与抑制炎症级联反应及抑制NF-κB 信号通路有关[27]。由KEGG 结果可知，马齿苋主要通过影响炎症信号通路、天然免疫信号通路等抵抗IBS-D。此外，可以看出同一靶点可参与调控多条信号通路，这也印证了中药同病异治的治疗特点。

将马齿苋活性化合物与关键靶点进行分子对接并计算结合能。结合能分值≥－4.00，则表明配体与靶点无法自发结合；结合能分值小于－4.00 且大于－7.00，则认为配体与靶点的结合活性较好；≤－7.00，则认为配体与靶点结合活性更为良好。研究分子对接结合能结果表明，马齿苋活性化合物均可与关键靶点蛋白自发结合，且结合活性较好。从分子对接结合模式图可知，马齿苋活性化合物多通过氢键作用力与靶蛋白相互作用。由于β-胡萝卜素不存在H 供体及受体，无法形成氢键，因此其主要通过范德华力、疏水结合Pi-Alkyl 作用等方式与靶蛋白结合。分子对接结果进一步说明马齿苋主要活性成分可通过调控上述核心靶点对IBS-D 发挥治疗作用，验证了上述网络药理学结果的可靠性。马齿苋活性成分对核心蛋白良好的结合能力也表明马齿苋具有多靶点、多途径的治疗特点。

综上所述，通过网络药理学方法预测了马齿苋主要的活性成分、治疗IBS-D 的潜在作用靶点及通路并利用分子对接手段进行了验证，一定程度上揭示了马齿苋治疗IBS-D 的作用机制。研究后续将进一步通过体内、外实验对所得的马齿苋成分及IBS-D靶点加以验证，为马齿苋防治ISB-D 的临床应用奠定基础。