基于UPLC-Q-TOF-MS/MS及网络药理学探讨麻杏止哮颗粒治疗哮喘的有效成分和作用机制

王 玉，于桂芳，胡军华，周 茆，肖 伟, ，王振中, *

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS及网络药理学探讨麻杏止哮颗粒治疗哮喘的有效成分和作用机制

王 玉1，于桂芳2, 3，胡军华2, 3，周 茆2, 3，肖 伟1, 2, 3，王振中1, 2, 3*

1. 南京中医药大学，江苏 南京 210023 2. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001 3. 中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术和网络药理学探讨麻杏止哮颗粒治疗哮喘的有效成分和作用机制。通过UPLC-Q-TOF-MS/MS技术及中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库筛选麻杏止哮颗粒的活性成分和相关靶点；利用Disgenet、Genecards数据库检索哮喘疾病靶点，利用韦恩图绘制平台获取共有靶点，并将信息导入Cytoscope3.9.1软件和STRING在线分析平台，进行网络拓扑学分析，构建药物关键活性成分-关键靶点网络和药物-有效成分-核心靶点网络；基于核心靶点通过DAVID数据库进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。结合质谱分析与数据库筛选得到药物活性成分24个，药物靶点147个，疾病靶点1483个，共同靶点106个，关键活性成分23个；经蛋白质相互作用分析及网络拓扑分析后，获取核心靶点10个，分别是肿瘤坏死因子、白细胞介素-6、细胞肿瘤抗原p53、白细胞介素-1β、血管内皮生长因子A、表皮生长因子受体、分裂原活化蛋白激酶3、半胱氨酸蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、纤连蛋白1，药物有效成分5个，包括槲皮素、异鼠李素、汉黄芩素、柚皮素、儿茶素；GO富集到基因功能69个，KEGG富集到基因通路70条，分析结果表明，麻杏止哮颗粒治疗哮喘的作用机制是通过调节晚期糖基化终末化产物-晚期糖基化终末产物受体信号通路在糖尿病并发症中的作用、分裂原活化蛋白激酶信号通路、白细胞介素-17信号通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信号通路、人类巨细胞病毒感染通路等来发挥治疗哮喘的作用。初步揭示了麻杏止哮颗粒治疗哮喘的有效成分和作用机制，为麻杏止哮颗粒药效物质基础研究奠定基础，为质量控制提供参考依据。

麻杏止哮颗粒；哮喘；UPLC-Q-TOF-MS/MS；网络药理学；槲皮素；异鼠李素；汉黄芩素；柚皮素；儿茶素

支气管哮喘，简称哮喘，是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性呼吸系统疾病。我国乃至全球的支气管哮喘发病率正在逐年上升，据全球哮喘防治创议预计，2025年全球哮喘患者将增加至4亿[1]。哮喘造成的疾病负担严重影响了患者生活质量，造成了巨大的个人和社会经济负担。目前，如何防治哮喘已成为我国医学界所面临的重要课题之一。中医在治疗支气管哮喘方面有着独特的优势，遵循整体观念和辨证论治的原则，通常采用多种治疗手段、给药途径相结合，不仅可以改善患者的症状，同时可以改善肺功能、炎症反应等，而且可以消除病理产物，缩短疗程，增强体质，提高抗病能力，预防复发[2]。

麻杏止哮颗粒是江苏康缘药业股份有限公司研制的治疗哮喘的现代中药，处方由蜜麻黄、苦杏仁、桑白皮、黄芩、前胡、甘草等13味药组成。其功能主治为宣肺平喘、清热化痰、息风解痉，用于支气管哮喘慢性持续期，症见喘息、气急、胸闷、咳嗽、咽喉不利等属热哮证者。麻杏止哮颗粒对于哮喘表现出良好的临床治疗效果，但是该处方潜在的有效成分及作用机制尚不明确。因此，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对麻杏止哮颗粒的化学成分进行分析和鉴定，以网络药理学为主要研究方法，对麻杏止哮颗粒治疗哮喘的有效成分和作用靶点进行筛选，揭示麻杏止哮颗粒治疗哮喘的作用机制，为麻杏止哮颗粒的临床应用及后续研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290 infinity超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），Agilent 6538 Q-TOF质谱仪（美国安捷伦公司）；Musshunter 色谱工作站和Qualitative Analysis质谱分析软件；Mettler Toledo AL204型万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；Mettler Toledo XP6型百万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KB-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TG16MW型台式高速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；Milli-Q型超纯水仪（美国密理博公司）。

1.2 试药

麻杏止哮颗粒（江苏康缘药业股份有限公司，批号200801）；甲醇（分析纯，批号20211105，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（质谱纯，批号21125087，MTEDIA）；甲酸（质谱纯，批号202674，赛默飞世尔科技（中国）有限公司），超纯水（自制）。对照品精氨酸（批号140685-201707，质量分数99.9%）、蔗糖（批号111507-201704，质量分数100.0%）、缬氨酸（批号140681-201703，质量分数99.5%）、酪氨酸（批号140609-201914，质量分数99.9%）、没食子酸（批号110831-201906，质量分数91.5%）、苯丙氨酸（批号111615-200301，质量分数100.0%）、盐酸伪麻黄碱（批号171237-201510，质量分数99.8%）、绿原酸（批号110753-2021119，质量分数98.0%）、异绿原酸A（批号111782-201807，质量分数94.3%）、异绿原酸C（批号111894-202103，质量分数89.6%）、原儿茶酸（批号110809-201205，质量分数99.9%）、甘草苷（批号111610-201908，质量分数95.0%）、迷迭香酸（批号111871-202007，质量分数98.1%）、黄芩苷（批号110715-202122，质量分数94.2%）、汉黄芩苷（批号112002-201702，质量分数98.5%）、汉黄芩素（批号111514-201706，质量分数95.0%）、芦丁（批号100080-201409，质量分数92.6%）、次野鸢尾黄素（批号111557- 201703，质量分数99.9%）、白花前胡甲素（批号111711-201904，质量分数99.4%）、白花前胡乙素（批号111904-201804，质量分数98.9%）、黄芩素（批号111595-201808，质量分数97.9%）、琥珀酸（批号110896-200001，质量分数95.0%）均购自中国食品药品检定研究院；异绿原酸B（批号MUST-22010705，质量分数98.27%）购自成都曼思特生物科技有限公司；芹糖甘草苷（批号wkq918020107，质量分数98.0%）购自四川省维克奇生物科技有限公司；毛蕊异黄酮（批号ST08810120-10103，质量分数98.0%）、甘草酸（批号RS00661020-5559，质量分数96.3%）均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；千层纸素苷（批号M20H182557，质量分数98.0%）购自上海源叶生物科技有限公司；白花前胡丙素（批号180927，质量分数98.0%）购自南京森贝伽生物科技有限公司；新绿原酸（批号BCBL3529V，质量分数98.0%）购自Sigma公司；天冬氨酸（批号A1330000-0077Q5，质量分数99.9%）购自European Pharmacopoeia Reference Standard公司。

1.3 数据库与软件

中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）；DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/）；Genecards数据库（http:// www.genecards.org/）；Unitprot数据库（http://www. Unitprot.org/）；STRING平台（https://string-db.org/）；Cytoscape 3.9.1软件（https://cytoscape.org/）；DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）；韦恩图绘制平台（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）；微生信在线平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 麻杏止哮颗粒研成细粉后，取粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，超声处理（500 W、40 kHz）30 min，放冷，摇匀，离心，取上清液过0.22 μm滤膜，取续滤液，即得。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取对照品酪氨酸、芹糖甘草苷、白花前胡丙素、天冬氨酸和毛蕊异黄酮各1 mg及其余25个对照品各5 mg，置于50 mL棕色量瓶中，加入甲醇并定容至刻度，制备成酪氨酸、芹糖甘草苷、白花前胡丙素、天冬氨酸和毛蕊异黄酮质量浓度均为20 μg/mL，及其余25个对照品质量浓度均为100 μg/mL的混合对照品溶液，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：Waters Atlantis T3C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）色谱柱；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～5 min，0～5% B；5～12 min，5%～11% B；12～20 min，11%～19% B；20～22 min，19%～20% B；22～27 min，20% B；27～34 min，20%～30% B；34～44 min，30%～40% B；44～56 min，40%～90% B；56～58 min，90%～100% B；58～60 min，100% B；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长300 nm。

2.3 质谱条件

离子化模式为电喷雾正、负离子模式，正负离子源电压均为4000 V，离子扫描范围为/100～3000，干燥气体积流量10 L/min，干燥气温度350 ℃，雾化压力344.75 kPa，锥孔电压65 V，裂解电压135 V，二级碰撞能量分别采用10、20、30、40 eV。

2.4 化学成分分析

结合查阅中英文相关文献与搜索TCMSP在线数据库，收集麻杏止哮颗粒组方13味药材的化学成分信息，建立化合物数据库。通过对麻杏止哮颗粒样品进行一级质谱分析，利用Musshunter色谱工作站和Qualitative Analysis质谱分析软件生成化合物分子式，选择误差在5×10−6以内的分子式进行数据库自动匹配，快速指认可能的化合物；进而选择目标化合物进行二级质谱扫描，得到化合物的碎片离子信息，结合对照品裂解规律以及文献资料对目标化合物进行鉴定和分析，并对药材来源进行归属。

2.5 药物活性成分及对应靶点筛选、哮喘疾病靶点预测

基于“2.4”项药物质谱分析得到的结果，通过TCMSP筛选口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18的活性成分，同时查找活性成分对应的靶点蛋白，通过Unitprot数据库确定靶点蛋白的基因简称。以“asthma”为关键词对DisGeNET数据库和Genecards数据库进行检索，对哮喘的相关基因进行检索，将搜索结果整合去重后，建立哮喘的预测靶点库。

2.6 药物关键活性成分-关键靶点的网络构建

利用韦恩图在线绘制工具将药物活性成分的作用靶点与疾病靶点进行匹配映射，获得两者共同的基因即麻杏止哮颗粒治疗哮喘的关键作用靶点，将关键作用靶点对应的活性成分预测作为麻杏止哮颗粒治疗哮喘疾病的关键活性成分，以Cytoscape3.9.1软件构建麻杏止哮颗粒“关键活性成分-关键靶点”网络。

2.7 药物有效成分-核心靶点的网络构建

将关键作用靶点上传至STRING平台，物种设为“Homo sapiens”，设定高级筛选条件“high confidence（0.700）”，构建关键靶点蛋白相互作用关系网络图；将得到的结果以TSV格式下载并保存，导入Cytoscope3.9.1软件，利用其中的“Network Analyzer”功能进行网络拓扑学分析。利用连接度（degree）、介度（betweeness）、紧密度（closeness）3个拓扑参数进行筛选，首次筛选以degree值中位数的2倍作为筛选条件，第二次筛选取degree、betweeness、closeness这3个参数的中位数作为筛选条件，筛选后获得核心靶点，构建核心靶点筛选过程网络图。将核心靶点对应的活性成分预测作为麻杏止哮颗粒治疗哮喘疾病的有效成分，将两者导入Cytoscope 3.9.1软件构建“麻杏止哮颗粒有效成分-核心靶点”网络图。

2.8 基因本体（gene ontology，GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

利用DAVID数据库对核心靶点基因进行GO功能分析和KEGG通路富集分析，物种设为“Homo sapiens”，设定＜0.01，分析麻杏止哮颗粒的潜在生物学过程和通路，根据富集基因数目由多到少进行降序排列，利用微生信平台对位居前列的生物学过程和通路绘制GO功能富集分析柱状图和KEGG通路富集分析气泡图。

3 结果

3.1 化学成分分析

麻杏止哮颗粒样品和混合对照品的正、负离子模式的总离子流图见图1。共鉴定和推测出121个化合物，其中30个化合物经对照品比对得到验证，见表1。

A-麻杏止哮颗粒正离子 B-麻杏止哮颗粒负离子 C-混合对照品正离子 D-混合对照品负离子

3.2 药物活性成分及对应靶点筛选、哮喘疾病靶点预测

基于质谱分析结果，通过TCMSP筛选得到24个药物活性成分，具体信息见表2，检索活性成分对应的作用靶点共147个。通过DisGeNET数据库和Genecards数据库，检索哮喘的作用靶点，分别以Score≥0.1及Score≥1为参数对作用靶点结果进一步筛选，获得哮喘疾病的作用靶点1483个。

表1 麻杏止哮颗粒中化学成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定

Table 1 Identification of chemical components in Maxing Zhixiao Granules by UPLC-Q-TOF-MS/MS

峰号tR/min离子模式检测值(m/z)理论值(m/z)误差(×10−6)分子式化合物离子碎片 (m/z)归属 10.626[M－H]−271.171 2271.170 4 2.93C18H24O2雌二醇[3]119.975 0、183.921 5B 21.663[M＋H]+175.118 3175.119 0 3.76C7H10O5精氨酸[4]*112.086 7、158.090 8B、E～G 31.750[M＋H]+133.096 9133.097 2−2.25C5H12N2O2鸟氨酸[4]116.033 6E 41.769[M＋H]+134.044 9134.044 8 0.46C4H7NO4天冬氨酸[4]*88.039 2、90.900 4、116.034 6B、E、G、K 51.968[M－H]−181.071 7181.071 8−0.38C6H14O6甘露醇[4]89.023 7、101.024 6、163.060 2F、H 62.233[M＋H]+116.070 3116.070 6−2.28C5H9NO2脯氨酸[4]70.065 1、72.936 2、98.057 6B、E、G、J 72.338[M－H]−341.107 9341.108 9−2.88C12H22O11蔗糖[4]*119.034 6J 82.393[M＋H]+187.039 8187.039 0 4.52C11H6O3异补骨酯素[5]103.056 7、131.087 0H 92.635[M－H]−359.149 0359.150 0−2.67C20H24O6异落叶松脂素[6]313.119 7F 102.651[M＋H]+118.086 7118.086 3 3.09C5H11NO2缬氨酸[4]*55.054 4、72.081 2B、E、G、J、K 112.931[M－H]−133.014 3133.013 4 0.47C4H6O5苹果酸[7]71.014 6、115.003 3J 124.004[M＋H]+136.062 2136.061 8 3.00C5H5N5腺嘌呤[4]119.033 0、136.060 7G 134.269[M＋H]+243.232 1243.231 9 0.79C15H30O2十五烷酸[8]131.048 2A、C、G、J、K 144.288[M＋H]+124.039 5124.039 3 1.49C6H5NO2烟酸[8]78.034 1、80.049 1、106.028 5G 154.887[M＋H]+148.060 8148.060 4 2.91C5H9NO4谷氨酸[4]85.034 6、102.994 5、130.118 6B、E～G、 K 165.553[M－H]−117.019 2117.019 3−1.18C4H6O4琥珀酸[8]*73.030 7、99.025 7C、G、J、K 175.843[M－H]−180.066 2180.066 1 0.78C9H11NO3酪氨酸[4]*119.050 0、163.039 3E～G、K 185.981[M＋H]+276.144 7276.144 2 1.93C12H21NO6glutarylcarnitine[8]161.073 4、212.129 5、230.138 0、258.130 9G 196.624[M＋H]+137.046 2137.045 8 2.75C5H4N4O次黄嘌呤[8]110.030 7、119.033 9、120.970 0F、G、J、K 206.729[M＋H]+268.104 2268.104 0 0.61C10H13N5O4腺苷[8]136.061 2、119.034 6G、I、J 216.754[M＋H]+100.075 8100.075 7 0.66C5H9NO2-哌啶酮[8]55.934 5、58.029 2、59.450 2、72.937 7G 227.024[M＋H]+166.123 4166.122 6 4.78C10H15NO麻黄碱[9]117.026 5、133.082 6、148.114 3A、K 237.270[M＋H]+284.100 0284.098 9 4.02C10H13N5O5鸟苷[8]152.056 6E、G 247.307[M＋H]+269.089 0269.088 0 3.58C10H12N4O5肌苷[8]137.045 8E、G、K 257.932[M－H]−169.013 9169.014 2−1.69C7H6O5没食子酸[10]*169.010 2、289.660 1H～K 268.516[M＋H]+166.086 2166.086 3−0.35C9H11NO2苯丙氨酸[4]*103.054 1、120.080 3E～G、J 279.112[M＋H]+310.129 1310.128 5 2.06C15H19NO6(S)-2-{[ (benzyloxy)carbonyl]amino}-5-ethoxy- 5-oxopentanoic acid[8]120.081 2、178.085 8、264.118 7、292.126 4G 289.143[M＋H]+152.107 5152.107 0 3.48C9H13NO去甲麻黄碱[9]117.069 3、134.095 4A 299.250[M＋H]+152.107 0152.107 0 0.11C9H13NO去甲伪麻黄碱[9]117.069 6、134.098 3A 309.285[M＋H]+328.139 7328.139 1 1.70C15H21NO7果糖苯丙氨酸[8]132.081 1、166.088 9、264.118 7、310.125 1G 3110.761[M＋H]+243.086 8243.087 7−3.49C12H10N4O27,8-二甲基苯并蝶啶-2,4-二酮7[8]157.007 0G 3211.440[M＋H]+166.122 5166.122 6−0.71C10H15NO伪麻黄碱[9]*117.056 8、133.087 7、148.111 6A、K 3311.829[M－H]−153.019 9153.019 3 3.70C7H6O4原儿茶酸[11]*91.018 4、109.028 6A、C、E、 K、M

续表1

峰号tR/min离子模式检测值(m/z)理论值(m/z)误差(×10−6)分子式化合物离子碎片 (m/z)归属 3412.947[M－H]−315.052 0315.051 0 3.02C16H12O7异鼠李素[12]107.385 3、300.012 2I、M 3516.368[M＋H]+181.050 1181.049 5 3.19C9H8O4咖啡酸[11]117.030 6、145.027 8、163.038 1J、K 3616.522[M－H]−353.086 2353.087 8−4.58C16H18O9新绿原酸[13]*135.044 2、179.074 7、191.056 9C 3716.535[M＋H]+163.039 5163.038 9 3.33C9H6O37-羟基香豆素[7]107.048 2、117.031 7、135.042 5、145.027 4C、H、J 3816.683[M－H]−353.086 2353.087 8−4.58C16H18O9绿原酸[13]*191.057 9、179.046 7J 3916.801[M＋H]+458.166 3458.165 7 1.32C20H27NO11苦杏仁苷[9]296.110 3B 4018.764[M＋H]+295.128 5295.128 8−1.10C14H18N2O5谷氨酰苯丙氨酸[8]103.053 8、120.079 9G 4121.324[M－H]−303.050 1303.051 0−3.12C15H12O72, 3-二氢槲皮素[14]125.025 2C 4221.373[M＋H]+565.155 7565.155 2 0.82C26H28O14异夏佛塔苷[15]481.108 0、511.118 2M 4321.342[M＋H]+325.144 6325.143 4 3.84C20H20O4光甘草定[16]189.017 2B、M 4421.694[M＋H]+366.190 8366.191 1−0.90C19H27NO6氧化苦参碱[7]150.091 5、168.101 5J 4521.750[M＋H]+366.190 8366.191 1−0.90C19H27NO6肾形千里光碱/新克式千里光宁碱及其他同分异构体[13]122.060 4、150.091 1、168.101 2J 4622.206[M＋H]+579.171 2579.170 8 0.63C27H30O14牡荆素-2-O-鼠李糖苷[17]284.839 0、433.118 1A 4723.342[M＋H]+549.160 7549.160 8 0.68C26H28O13白杨素-6-C-阿拉伯糖- 8-C-葡萄糖苷[18]375.082 0、393.092 3、411.113 7、513.143 3D 4823.714[M－H]−547.143 9547.145 7−3.28C26H28O13chrysin-6-C-β-L-arabino-pyranosyl-8-C-β-D-glucopyranoside[19]427.100 7、457.111 2、487.119 9、547.146 2D 4923.967[M－H]−549.161 0549.161 4−0.76C26H30O13芹糖甘草苷[20]*135.008 6、255.059 4、417.119 5M 5024.028[M－H]−417.119 3417.119 1 0.56C21H22O9新甘草苷/异甘草苷/新异甘草苷[9]135.040 4、255.065 9M 5124.084[M＋H]+611.160 6611.160 6−0.13C27H30O16芦丁[7]*303.049 0、465.065 2C、J 5224.319[M＋H]+257.081 4257.080 8 2.52C15H12O4甘草素/异甘草素[9]119.083 5、137.005 6、147.045 7B、M 5324.473[M－H]−417.118 9417.119 1−0.56C21H22O9甘草苷[9]*135.093 0、255.062 4B、M 5424.591[M＋H]+419.133 9419.133 7 0.56C21H22O9新异甘草苷[20]255.062 4、419.209 0M 5525.018[M－H]−301.034 8301.035 4−2.15C15H10O7槲皮素[12]107.014 6、121.027 1、151.004 3、179.096 4A、C、F、 H～J、M 5625.099[M－H]−301.034 8301.035 4−2.15C15H10O7粘毛黄芩素Ⅰ[10]283.023 5D 5725.641[M＋H]+387.156 4387.155 1 3.23C20H22N2O6N-acetyldopamine dimer A[21]150.056 3、192.062 8、269.078 5、328.116 2E 5827.188[M＋H]+301.071 2301.070 7 1.82C16H12O65,7,2'-三羟基-6-甲氧基黄酮[18]117.072 5、286.037 3D 5927.425[M－H]−515.117 9515.119 5−3.16C25H24O12异绿原酸B[13]*135.041 5、179.032 4、191.061 2J 6029.166[M－H]−515.117 9515.119 5−3.16C25H24O12异绿原酸A[13]*135.041 4、173.042 6、179.032 8、353.083 2J 6131.146[M＋H]+523.144 2523.144 6−0.71C24H26O13野鸢尾苷[22]346.062 5、361.091 5I 6231.546[M－H]−515.118 0515.119 5−3.16C25H24O12异绿原酸C[13]*135.042 4、161.022 6、173.046 8、179.033 3、 191.056 4、353.085 9J 6332.244[M－H]−359.077 2359.077 2−0.13C18H16O8迷迭香酸[11]*123.043 6、135.042 0、179.033 2、197.044 4A、L 6432.788[M＋H]+477.103 4477.103 3 1.36C22H20O125,7,2'-三羟基-6-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷[18]301.068 6D 6533.437[M－H]−549.160 1549.161 4−2.32C26H30O13芹糖异甘草苷[23]255.066 0M 6633.497[M－H]−415.101 6415.103 5−4.52C21H20O9芹菜素-5-鼠李糖苷[17]285.653 4A 6733.775[M＋H]+431.135 1431.133 7 3.31C22H22O9芒柄花苷[9]269.079 8M

续表1

峰号tR/min离子模式检测值(m/z)理论值(m/z)误差(×10−6)分子式化合物离子碎片 (m/z)归属 6834.449[M＋H]+447.091 3447.094 7−2.00C21H18O11黄芩苷[24]*271.059 3D 6934.498[M＋H]+271.060 2271.058 9 0.29C15H10O5芹菜素[24]242.050 1、269.004 2A、D、I、L、M 7035.034[M－H]−431.096 5431.098 4−4.49C21H20O10芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷[25-26]65.005 7、83.597 4、182.946 8、269.045 7D 7135.514[M－H]−287.055 4287.056 1−2.43C15H12O6二氢山柰酚[25]125.023 8、201.055 2I 7235.938[M＋H]+273.077 6273.075 7 3.26C15H12O5柚皮素[20]255.063 2A、M 7335.988[M＋H]+291.087 1291.086 3 2.83C15H14O6儿茶素[26]206.959 6、273.068 9A、B 7436.189[M－H]−445.075 6445.077 6−4.41C21H18O11芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷[27]269.045 1D 7536.613[M＋H]+301.070 5301.070 7−0.72C16H12O6韧黄芩素Ⅱ[18]286.046 3D 7636.787[M＋H]+477.102 7477.103 3−0.27C22H20O125,7,8-三羟基-6-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷[18]301.068 6D 7737.131[M＋H]+431.097 4431.097 8 0.18C21H18O10白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷[18]255.059 9D 7837.212[M＋H]+461.106 9461.108 4−1.91C22H20O11千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷[18]*270.049 4、285.074 4D 7937.570[M＋H]+477.102 8477.103 3 0.01C22H20O125,6,7-三羟基-8-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷[18]301.069 4D 8038.351[M－H]−283.060 2283.061 2−3.63C16H12O5千层纸素A[10]268.038 0D 8138.426[M－H]−283.060 3283.061 2−3.63C16H12O5汉黄芩素[10]*239.034 6、268.037 8D 8238.426[M－H]−283.060 2283.061 2−3.63C16H12O5樱黄素[12]167.995 2、257.315 1I、M 8338.545[M＋H]+461.107 9461.109 0 0.28C22H20O11汉黄芩苷[24]*285.075 8D 8438.879[M＋H]+491.119 7491.119 0 2.67C23H22O125,7-二羟基-6,8-二甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷[18]300.063 4、315.087 3D 8539.177[M＋H]+487.143 5487.145 2−2.34C21H26O137-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyra-nosyl-scopoletin[9]80.950 7、253.017 0、279.196 5H 8641.621[M＋H]+475.124 4475.124 0 1.83C23H22O11黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷乙酯[18]271.056 5D 8741.774[M＋H]+217.050 0217.049 5 2.38C12H8O4佛手苷内酯/花椒毒素[9]161.118 2、174.031 9、202.023 7H 8842.233[M－H]−299.055 6299.056 1−1.52C16H12O6粗毛豚草素[27]255.030 2、284.030 5I 8942.659[M＋H]+301.071 4301.070 7 2.37C16H12O6柯伊利素[28]153.020 4J 9042.677[M＋H]+331.081 9331.081 2 2.06C17H14O7苜蓿素[29]331.083 6I 9142.778[M－H]−329.066 8329.066 7 0.04C17H14O7槲皮素-3,3'-二甲醚[12]243.028 4、271.024 0、299.017 8、314.047 1M 9243.023[M＋H]+271.061 0271.060 6 1.99C15H10O5去甲汉黄芩素[18]241.047 2、253.038 6D 9343.097[M＋H]+271.060 7271.060 6 0.74C15H10O5黄芩素[24]*242.053 7D 9444.598[M＋H]+219.102 2219.101 6 2.63C13H14O32,2-二甲基-6-乙酰基苯骈二氢吡喃酮[13]77.034 0、107.049 5、121.027 0J 9544.730[M－H]−837.390 8837.391 4−0.77C42H62O17甘草皂苷G2[23]193.034 1、351.055 7M 9645.110[M＋H]+257.247 0257.247 5−1.87C16H32O2棕榈酸[8]199.066 4A～D、G、 H、J～L 9746.753[M＋H]+471.347 1471.346 9 0.41C30H46O4甘草次酸[24]189.168 1、453.338 6M 9846.965[M－H]−821.395 9821.396 5−0.77C42H62O16甘草酸[23]*193.032 8、351.053 9、645.337 8、803.368 8B、M

续表1

峰号tR/min离子模式检测值(m/z)理论值(m/z)误差(×10−6)分子式化合物离子碎片 (m/z)归属 9947.798[M－H]−225.184 9225.186 0−4.99C14H26O29-十四碳烯酸[8]139.000 7、165.052 3、167.040 3G 10048.371[M＋H]+387.106 7387.107 4−1.81C20H18O8次野鸢尾黄素[30]*326.077 6、341.066 1、357.060 4、372.083 2I 10148.828[M＋H]+285.076 6285.075 7 3.13C16H12O5毛蕊异黄酮[12]*225.049 9、270.051 2M 10249.076[M＋H]+359.077 2359.076 1 3.17C18H14O8白射干素[31]181.013 2I 10349.205[M＋H]+375.107 2375.107 4−0.48C19H18O8黄芩黄酮Ⅱ[18]327.048 1、345.059 7、360.080 7D 10449.423[M＋H]+375.107 2375.108 0−0.48C19H18O85,6-二羟基-6,8,2',3'-四甲氧基黄酮[18]345.056 9、360.083 7D 10549.446[M＋H]+347.221 8347.112 5 0.91C18H18O73′,4′-二乙酰氧基凯尔消旋内酯[9]245.075 8H 10651.051[M＋H]+279.232 2279.231 9 1.22C18H30O2亚麻酸[8]149.133 9A、B、F、G、K、L 10752.570[M＋H]+343.117 9343.117 6 0.81C19H18O6(+)-3'-当归酰氧基-4'-氧代-3',4'-二氢叶黄素[9]227.026 0H 10852.583[M＋H]+343.117 9343.117 6 0.81C19H18O6前胡香豆素E[9]261.563 1H 10952.912[M＋H]+345.133 7345.133 3 1.20C19H20O63'-isovaleryl-4'-ketokhellactone[9]243.064 3、261.074 9H 11053.543[M＋H]+329.138 8329.138 4 1.27C19H20O5丝立尼亭[32]227.067 9、245.081 5H 11153.580[M＋H]+387.145 3387.143 8 3.78C21H22O7北美芹素[9]287.551 4、227.067 8、245.075 4H 11253.673[M＋H]+287.092 3287.091 4 3.22C16H14O5甘草查耳酮B[33]245.080 2B、M 11353.846[M＋H]+345.132 8345.133 3−1.59C19H20O6(+)-(3'S,4'R)-3'-当归酰凯林内酯[9]227.067 4、327.199 4、245.080 1H 11453.956[M＋Na]+409.125 8409.125 8−0.51C21H22O7白花前胡甲素[9]*227.071 2、327.123 3H 11556.126[M＋H]+279.159 6279.159 1 1.75C16H22O4邻苯二甲酸二丁酯[34]93.033 5、121.027 1、149.023 0A、B、L、M 11656.150[M＋H]+427.175 0427.175 1−0.03C24H26O7白花前胡丁素[9]227.068 7H 11756.441[M＋H]+391.248 9391.247 9 2.56C23H34O5款冬酮[13]147.079 3、175.147 4J 11856.484[M＋H]+427.175 1427.175 1−0.03C24H26O7白花前胡乙素[9]*227.066 5H 11956.997[M＋H]+429.191 0429.190 8 0.55C24H28O7白花前胡丙素[9]*327.116 3H 12057.238[M＋H]+327.121 7327.122 7−3.10C19H18O5桑辛素O[35]133.080 0C 12157.893[M＋H]+329.138 4329.138 4−0.06C19H20O5紫花前胡素[36]229.084 1H

*与对照品比对确认的成分 A-蜜麻黄 B-苦杏仁 C-桑白皮 D-黄芩 E-蝉蜕 F-僵蚕 G-地龙 H-前胡 I-射干 J-款冬花 K-法半夏 L-紫苏子 M-甘草

*Compared with the reference substance A-honey-processedB-C-D-E-F-G-Pheretima H-I-J-K-L-M-

3.3 药物关键活性成分-关键靶点的网络构建

利用在线韦恩图绘制平台对药物靶点和疾病靶点交集进行计算并绘制，见图2，两者交集为关键靶点共106个，将关键靶点与其对应的23个关键活性成分导入Cytoscape3.9.1软件构建麻杏止哮颗粒“关键活性成分-关键靶点”网络，见图3。

3.4 药物有效成分-核心靶点网络构建

将106个关键靶点基因上传至STRING平台，构建关键靶点蛋白相互作用关系网络图，该网络一共含有靶蛋白节点106个，靶点蛋白间的相互作用关系连线698条，平均度值13.2，平均介数0.504，见图4。利用Cytoscope 3.9.1软件对构建的蛋白间相互作用（protein-protein interactions，PPI）网络进行拓扑学分析，首先以degree值中位数的2倍作为筛选条件，然后同时选取degree、betweeness、closeness这3个参数的中位数作为筛选条件（分别为26、0.028 8、0.505 0），筛选得到核心靶点10个，包括肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL6）、细胞肿瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）、白细胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、分裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，MMP9）、纤连蛋白1（fibronectin，FN1），核心靶点筛选过程网络图见图5，核心靶点信息见表3。核心靶点对应的有效成分有5个，分别是槲皮素、异鼠李素、汉黄芩素、柚皮素、儿茶素。将核心靶点与其对应的有效成分进行可视化分析，构建“麻杏止哮颗粒-有效成分-核心靶点”网络，见图6。

表2 麻杏止哮颗粒活性成分的基本信息

Table 2 Basic information on active ingredients of Maxing Zhixiao Granules

序号Mol ID成分名称OB/%DL/% 1MOL000098槲皮素46.430.28 2MOL000417毛蕊异黄酮47.750.24 3MOL002927黄芩黄酮Ⅱ69.510.44 4MOL013077紫花前胡素39.270.38 5MOL013078白花前胡丙素51.220.66 6MOL004908光甘草定53.250.47 7MOL004961槲皮素-3,3'-二甲醚46.450.33 8MOL004841甘草查耳酮B76.760.19 9MOL000354异鼠李素49.600.31 10MOL004576二氢槲皮素57.840.27 11MOL001735粗毛豚草素30.970.27 12MOL012719桑辛素O62.330.44 13MOL003044柯伊利素35.850.27 14MOL001792甘草素32.760.18 15MOL0005255,7,8-三羟基黄酮39.400.21 16MOL004903甘草苷65.690.74 17MOL013079白花前胡甲素46.460.53 18MOL000492儿茶素54.830.24 19MOL002714黄芩素33.520.21 20MOL010023氧化苦参碱56.160.41 21MOL002776黄芩苷40.120.75 22MOL004328柚皮素59.290.21 23MOL000173汉黄芩素30.680.23 24MOL002928千层纸素A41.370.23

图2 药物与哮喘交集靶点

3.5 GO功能分析及KEGG通路富集分析

对10个核心靶点基因进行GO功能分析和KEGG通路富集分析，筛选出69条GO分析结果，包括生物过程（biological process，BP）60个，细胞组分（cellular component，CC）5个，分子功能（molecular function，MF）4个，分别根据靶点富集数目的多少进行排序，将排名靠前的结果绘制柱状图（图7）。BP分析所示，麻杏止哮颗粒治疗哮喘的作用靶点主要涉及的生物过程有基因表达的正向调控、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、蛋白质磷酸化的正调节、凋亡过程的负调控等。如CC分析可以看出，靶点主要涉及细胞外间隙、细胞外区、大分子复合物、膜筏、内质网腔。如MF分析所示，靶点主要涉及的分子功能有相同的蛋白质结合、蛋白酶结合、细胞因子活性、整合素结合。

菱形代表关键活性成分，圆形代表关键靶点

图4 关键靶点蛋白相互作用关系网络图

中圈以内为首次筛选结果，内圈为二次筛选结果

表3 10个核心靶点信息

Table 3 10 core targets information

序号靶点简称Uniprot ID中文名称英文名称 1TNFP01375肿瘤坏死因子tumor necrosis factor 2IL6P05231白细胞介素-6interleukin-6 3TP53P04637细胞肿瘤抗原p53cellular tumor antigen p53 4IL1BP01584白细胞介素-1βinterleukin-1 beta 5VEGFAP15692血管内皮生长因子Avascular endothelial growth factor A 6EGFRP00533表皮生长因子受体epidermal growth factor receptor 7MAPK3P27361分裂原活化蛋白激酶3mitogen-activated protein kinase 3 8CASP3P42574半胱氨酸蛋白酶3caspase-3 9MMP9P14780基质金属蛋白酶9matrix metalloproteinase 9 10FN1P02751纤连蛋白 1fibronectin

图6 “麻杏止哮颗粒-有效成分-核心靶点”网络

此外，富集得到70条KEGG通路，将靶点富集数目排名前20的结果绘制气泡图，见图8，通路信息见表4。分析结果表明，麻杏止哮颗粒治疗哮喘的靶点主要涉及的通路有癌症中的蛋白聚糖、人类巨细胞病毒感染、癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、MAPK信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎等。

图7 核心靶点的GO富集分析

图8 核心靶点的KEGG通路富集分析

表4 核心靶点KEGG通路富集分析部分信息

Table 4 Partial information of core targets KEGG pathway enrichment analysis

编号信号通路P值基因数/个 hsa05205proteoglycans in cancer1.98×10−108 hsa05163human cytomegalovirus infection3.81×10−108 hsa05200pathways in cancer1.53×10−78 hsa04933AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications2.38×10−107 hsa05417lipid and atherosclerosis2.46×10−87 hsa04010MAPK signaling pathway1.60×10−77 hsa05165human papillomavirus infection3.24×10−77 hsa04657IL-17 signaling pathway2.22×10−86 hsa04668TNF signaling pathway5.39×10−86 hsa05161hepatitis B3.44×10−76 hsa05206microRNAs in cancer8.54×10−66 hsa04151PI3K-Akt signaling pathway1.63×10−56 hsa05219bladder cancer6.80×10−85 hsa05133pertussis8.47×10−75 hsa05146amoebiasis2.77×10−65 hsa05135yersinia infection8.99×10−65 hsa05418fluid shear stress and atherosclerosis9.53×10−65 hsa05160hepatitis C1.54×10−55 hsa05164influenza A2.17×10−55 hsa05152tuberculosis2.65×10−55

4 讨论

本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合多种网络药理学在线分析平台和数据库，从麻杏止哮颗粒中推测出121个化合物，进而筛选出治疗哮喘的23个关键活性成分和106个关键靶点，通过药物关键活性成分-关键靶点网络的构建，分析得出麻杏止哮颗粒并非通过单一成分、单一靶点治疗哮喘，而是多成分、多靶点的作用方式。进一步分析筛选，搭建药物-有效成分-核心靶点网络，最终得到麻杏止哮颗粒治疗哮喘的5个有效成分和10个核心靶点。

研究证实，槲皮素能够明显抑制炎症细胞因子分泌TNF-α、IL-1β及IL-6达到抗炎效果，还能够预防过敏原与血小板活化因子所诱导的支气管阻塞和支气管高反应[37]。异鼠李素通过显著降低哮喘小鼠IL-4、IL-5、IL-13、半胱氨酰白三烯受体1（cysteinyl leukotriene receptor 1，Cys LTR1）的表达，有效抑制哮喘中辅助性T细胞2（T helper cell 2，Th2）介导的免疫应答，改变辅助性T细胞1/辅助性T细胞2（Th1/Th2）细胞平衡发挥抑制炎症反应的作用[38]。柚皮素具有良好的止咳化痰平喘作用，能够显著抑制哮喘大鼠肺部和支气管的炎症反应，在体内外模型实验中证实柚皮素发挥抗炎的潜在作用机制与抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路有关[39]。汉黄芩素可通过多种机制改善气道炎症及肺功能，拮抗哮喘发病相关的多种因素，如诱导嗜酸性粒细胞凋亡和减弱Th2优势免疫介导过敏性气道炎症[40]。

研究发现，TNF受体中最主要的为TNF-α，TNF-α可以调控细胞因子、黏附分子和黏液素等的表达和释放，如诱导产生炎症因子IL-6等。IL-6、TNF-α两者在气道炎症中发挥着重要作用，参与调节免疫反应，促进炎症细胞的合成、释放炎症介质，都是支气管哮喘的主要炎症因子[41]。VEGFA通过加快愈合低氧而产生的组织损伤，从而参与哮喘气道的重塑环节[42]。Amishima等[43]经研究发现哮喘患者气道的支气管上皮、腺体、平滑肌等均可明显观察到EGF及EGFR的免疫反应。CASP3是细胞凋亡的关键一环，可通过内质网通路发挥调控细胞凋亡的作用，参与支气管哮喘气道重塑的过程[44]。

KEGG通路富集分析结果表明，麻杏止哮颗粒治疗哮喘的靶点主要涉及的通路有PI3K-Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、MAPK信号通路、人类巨细胞病毒感染等。其中，PI3K-Akt信号通路与支气管哮喘气道重塑密切相关，例如间充质干细胞可以作用于PI3K-Akt 信号通路，通过抑制大鼠哮喘模型的肺部炎症和气道重塑从而改善大鼠的哮喘症状[45]。MAPK信号通路是介导细胞氧化应激、增殖与凋亡等生命活动的重要信号传导系统，激活后能够促使炎性细胞因子生成，对哮喘发病过程中气道炎症、气道重塑和气道高反应性均具有重要的调控作用[46]。AGE-RAGE信号通路与炎症反应密切相关，该通路可以激活 MAPK及NF-κB，影响免疫及产生氧化应激反应[47]。人巨细胞病毒感染与支气管哮喘也有着密切联系，它可以使婴儿细小支气管的黏膜壁出现充血及水肿，使细支气管发生梗阻，严重情况可导致患儿死亡[48]。总之，通路富集分析结果提示了麻杏止哮颗粒治疗哮喘的复杂作用机制。

综上分析，本研究利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合网络药理学方法，对麻杏止哮颗粒治疗哮喘的有效成分和作用机制进行了初步预测，为麻杏止哮颗粒药效物质基础研究提供理论依据。但是本文的结果是基于生物信息学分析，仍属于理论水平的探讨，麻杏止哮颗粒的组成药味比如蜜麻黄中有着发汗、平喘功效的生物碱类等成分尚需做进一步的动物实验、细胞实验以及临床研究，对该方中的药效物质进行确认，并建立高效的活性评价方法，确定关键药效物质，以期全面的阐述其治疗哮喘的作用机制，为其质量标准研究提供更完善的参考依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Exploring effective components and mechanism of action of Maxing Zhixiao Granules in treatment of asthma based on UPLC-Q-TOF-MS/MS and network pharmacology

WANG Yu1, YU Gui-fang2, 3, HU Jun-hua2, 3, ZHOU Mao2, 3, XIAO Wei1,2, 3, WANG Zhen-zhong1,2, 3

1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China 3. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China

To explore the effective components and mechanism of acion of Maxing Zhixiao Granules in the treatment of asthma based on UPLC-Q-TOF-MS/MS technology and network pharmacology.The active components and related targets of Maxing Zhixiao Granules were screened by UPLC-Q-TOF-MS/MS technology and the database of Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP); The targets of asthma diseases were searched using Disgenet and Genecards databases, and the Venn diagram drawing platform was used to obtain common targets. The information was imported into Cytoscope 3.9.1 software and STRING online analysis platform for network topology analysis to construct drug key active ingredient-key target network diagram and drug-active ingredient-core target network; Gene ontology (GO) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) were enriched and analyzed by DAVID database based on core targets.Combined with mass spectrometry analysis and database screening, 24 active pharmaceutical ingredients, 147 drug targets, 1483 disease targets, and 106 common targets and 23 key active ingredients were obtained. After protein interaction analysis and network topology analysis, 10 core targets were obtained, including tumor necrosis factor, interleukin-6, cellular tumor antigen p53, interleukin-1 beta, vascular endothelial growth factor A, epidermal growth factor receptor, mitogen-activated protein kinase 3, caspase-3, matrix metalloproteinase-9, fibronectin, five active ingredients, including quercetin, isorhamnetin, wogonin, naringenin, catechin; GO was enriched to 69 gene functions, and KEGG was enriched to 70 gene pathways. The analysis results showed that the mechanism of action of Maxing Zhixiao Granules in the treatment of asthma is to regulate the role of advanced glycation end products-advanced glycation end products receptor signaling pathway in diabetic complications, mitogen-activated protein kinase signaling pathway, interleukin-17 signaling pathway, phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B signaling pathway, and human cytomegalovirus infection pathway, etc.This study preliminarily revealed the effective components and mechanism of action of Maxing Zhixiao Granules in the treatment of asthma, laying a foundation for the basic research on the pharmacodynamic substances of Maxing Zhixiao Granules and providing a reference for quality control.

Maxing Zhixiao Granules; asthma; UPLC-Q-TOF-MS/MS; network pharmacology; quercetin; isorhamnetin; wogonin; naringenin; catechin

R284.1

A

0253 - 2670(2023)17 - 5508 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.005

2023-01-21

科技部国家新药创制重大专项-中药经典名方开发（2015ZX09101043-003）

王 玉（1998—），女，硕士研究生，研究方向为中药制药技术与产品开发。E-mail: 3097076846@qq.com

王振中（1968—），男，博士，高级工程师，主要从事中药新剂型研发。E-mail: wzhzh-nj@163.com

[责任编辑 王文倩]