循环游离线粒体DNA作为新型肿瘤液体活检标志物的研究进展

彭帆，王思源，刘洋，邢金良

（空军军医大学基础医学院生理与病理生理学教研室，陕西 西安 710032）

癌症是全球主要的死亡原因之一，2020年全球新发癌症病例1 929万例，全球癌症死亡病例996万例，其中中国新发癌症457万例、癌症死亡300万例，分别占全球新发与死亡病例的23.7%、30.1%[1]。现阶段，用于癌症诊疗手段十分有限，传统检测方法主要是基于影像学、病理学以及血清学，金标准仍然是组织病理学检测，但其属于侵入性检查，伤害大，且在肿瘤早期无法定位获取组织，无法捕捉到肿瘤原发灶内部以及原发灶与转移灶之间的遗传异质性，影响了检测的准确性。近年来，液体活检技术逐渐进入人们视野。液体活检主要通过检测肿瘤原发灶或转移灶释放到外周血或其他体液中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）或外泌体，从而达到诊断或监测肿瘤的目的。液体活检技术解决了传统的组织活检技术的主要缺点，并以无创重复取样、可实现早期诊断、实时动态监测和克服肿瘤异质性等诸多优势而备受青睐[2]，正在成为精准肿瘤学中传统组织活检的有利替代[3]。游离DNA（cell free DNA，cfDNA）是目前的热点研究方向。然而，现有的基于游离核DNA（cell free nDNA，cf-nDNA）的检测技术面临检测周期长、成本高、检测特异性和敏感性不足、技术复杂、重复性不佳等问题[4]。循环游离线粒体DNA（cell free mitochondrial DNA，cf-mtDNA）的存在已在多种癌症的多项研究中得到证实[5-8]，并表现出良好的性能。同时，mtDNA的独特特征使循环cfmtDNA更容易在患者外周血或其他体液中进行定性及定量检测。最近开展的大规模测序工作强调了cfmtDNA在包括癌症在内的各种临床疾病中的重要作用[9]。同时，基于cf-mtDNA各项特征的精准检测技术层出不穷，使得其特征挖掘更加全面、具体。因此，作为一种具有独特优势的新型肿瘤生物标志物，cf-mtDNA在精准肿瘤学方面具有很大的应用前景。然而，目前对血浆cf-mtDNA的生物学特性和临床应用的了解还很少。综述将对cf-mtDNA分析指标和检测技术进行系统介绍。

1 cf-mtDNA拷贝数

与nDNA的双拷贝不同，每个线粒体里通常含有数百至数千个DNA拷贝[10]。研究表明，mtDNA拷贝数与线粒体能量代谢异常、细胞内环境的紊乱、细胞生长的异常密切相关[11]。目前，针对线粒体基因组的拷贝数的检测开发了很多技术方法。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是最常用于mtDNA拷贝数检测的方法[12]。通过设计用于扩增mtDNA中ND1基因的引物与用于扩增nDNA中HGB-1基因的引物实现mtDNA拷贝数的相对定量[13]。Jiang等[14]基于qPCR计算ND4、ND1的含量，并用二者的比值反映血浆cf-mtDNA的完整性。然而由于血浆cf-mtDNA的片段化，上下游引物覆盖区域有限，导致检测结果不准确。随着测序技术的发展，全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）也被广泛应用于mtDNA拷贝数的检测，并且适用于任何类型的样本。cf-mtDNA的含量最早被发现可作为癌症检测的生物学指标，Jiang等[9]利用WGS发现，与对照组相比，肝细胞癌患者的cf-mtDNA含量升高，且血浆中的cf-mtDNA比cf-nDNA片段更短。多项研究相继证实，cf-mtDNA含量在肺癌[12]、子宫内膜癌[15]、结直肠癌[16]、乳腺癌[17]中显著升高，提示cf-mtDNA含量具有一定的肿瘤诊断价值。然而，Perdas等[18]首次发现与健康对照相比，甲状腺乳头状癌患者血浆cf-mtDNA含量显著降低，且具有较高特异性，对于后续治疗方案制定起到助力作用。Kalavska等[19]通过对接受化疗的晚期卵巢癌患者血浆cf-mtDNA含量进行纵向检测，发现化疗后血浆cf-mtDNA含量显著降低，且与预后相关。Jiang等[14]基于含量计算的cf-mtDNA完整性在肿瘤诊断中也具有一定的意义，因为血浆中检测到的完整mtDNA的释放增加是一种肿瘤特异性过程，据此可区分正常患者与甲状腺癌患者。此外，Bulgakova等[20]通过比较肺癌患者、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者及健康对照发现，cf-mtDNA拷贝数的增加与COPD和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的发展显著相关并引起较差预后，提示cf-mtDNA是NSCLC的诊断和预后的生物标志物。此外，Li等[8]通过提取肝癌患者、肝炎患者及正常对照共计15例临床血浆样本的cfDNA和外泌体DNA，利用WGS和mtDNA靶向捕获测序技术分析发现，与血浆cf-mtDNA相比，外泌体中mtDNA拷贝数高于血浆中mtDNA拷贝数，且外泌体中mtDNA拷贝数在肝炎患者、肝癌患者与正常对照间存在差异性。

2 cf-mtDNA突变

近年来cf-mtDNA突变相关研究陆续被报道。多项研究证实，mtDNA体细胞突变的积累可导致线粒体功能紊乱，促进肿瘤恶性发展。mtDNA突变是肿瘤发生发展过程中最常见的遗传学事件之一，通过影响在氧化呼吸链中发挥重要作用的基因，进一步影响线粒体代谢稳态。最早Polyak研究团队针对肠癌细胞系、原位肠癌肿瘤组织及正常结肠组织进行测序时发现，肠癌细胞系中存在mtDNA体细胞突变[21]。此后，大量研究开展对mtDNA突变的研究，证实超过50%的肿瘤存在mtDNA体细胞突变，比nDNA突变高约10 ~ 17倍[22-23]。与ctDNA突变检测技术方法类似，cf-mtDNA突变检测方法主要分为2类：基于PCR的数字PCR（digital PCR，dPCR）、BEAMing（bead，emulsion，amplification and magnetic）、突变扩增系统（amplification refractory mutation system，ARMS）等技术以及基于第二代测序（next-generation sequencing，NGS）的靶向富集技术。dPCR是一种新型核酸检测方法，能够对核酸类肿瘤标志物进行高灵敏性和高精确度的绝对定量，可以从DNA分子层面鉴定基因突变，突变检出限可达0.01%。市面上常见的dPCR仪主要分为微滴式和芯片式2种。目前已有包括国外的RainDance公司和Bio-Rad公司以及国内的泛生子和科维思等几家公司相继推出了基于dPCR检测的产品，并已广泛地应用于稀有突变检测、拷贝数变异分析和复杂样本基因表达检测等方面。BEAMing技术结合了dPCR与流式检测技术，用于检测罕见突变。ARMS是Newton等[24]针对已知突变建立的基于PCR的检测方法。上述基于PCR的3种技术方法操作简单，灵敏性较高、稳定性和准确率良好，但通量较低，只能检测已知突变，未来发展能力有限。NGS作为检测未知突变的主要方法，具有其他技术难以比拟的优势。基于NGS的靶向富集技术主要包含2类：靶向扩增[25]与靶向杂交捕获[26]。靶向扩增是通过设计mtDNA特异性扩增引物实现目标区域的富集。Liu等[27]发现，PCR扩增子内高度可变的测序深度严重降低了突变识别的覆盖均匀性和准确性。因此，研究人员优化了基于靶向扩增的mtDNA测序策略，通过调整引物设计方法，包括引物对数量、扩增子重叠长度和引物修饰对，实现了线粒体基因组的均匀覆盖，为mtDNA突变检测奠定了技术基础。同时发现DNA质量对于PCR扩增效率的影响较大，靶向扩增方法对于DNA质量较差的血浆、福尔马林固定石蜡包埋（formalin fixation and paraffin embedding，FFPE）组织、古生物等样本的富集效率较低。总体来讲，靶向扩增方法的特异性较强，但引物设计复杂、PCR过程易产生假阳性且无法检测cf-mtDNA片段组学信息。靶向杂交捕获技术通过制备与mtDNA互补配对的生物素标记探针实现目标区域的富集。与基于PCR的靶向扩增方法不同，探针靶向杂交捕获可使整个基因组被重叠探针所覆盖，这些探针用于杂交反应以捕获与其互补DNA序列，能够靶向更多的区域，并且更全面地分析所有变异类型。Liu等[28]前期建立了一种基于靶向杂交捕获的cf-mtDNA突变检测技术，利用单链建库技术与分子标签相结合，通过靶向杂交捕获富集mtDNA文库，克服了游离cf-mtDNA片段化程度高的问题，能够富集更多的cf-mtDNA，并且分子标签克服了PCR扩增和测序错误导致的假阳性问题，显著提高了游离mtDNA低频突变检测的准确性。此外，研究人员通过系统地比较不同的探针浓度、探针长度、杂交温度以及PCR扩增次数等因素对检测mtDNA突变及含量的准确性及性价比的影响，最终确定最优化的NGS检测新方案，该方法可高效地检测cf-mtDNA突变。

Weerts等[29]使用单分子实时（single molecule real time，SMRT）测序技术检测了8名癌症患者（5名乳腺癌、3名结肠癌）的19个组织样本和9个血浆样本的mtDNA突变，结果发现使用现有方法追踪血浆中肿瘤特异性cf-mtDNA变异的价值有限。出现上述结果的可能原因是SMRT检测突变的灵敏度较低，更适合结构变异的检测。然而肿瘤组织存在瘤内异质性，所以单一或少量的肿瘤组织不能反映完整的肿瘤信息。Vikramdeo等[30]首次证实mtDNA突变可以在血浆外泌体中检测到，并有可能作为一种可靠的胰腺导管腺癌的诊断工具。Riehl等[31]在神经母细胞瘤进展前和进展期间的血浆样本中检测到肿瘤相关的mtDNA体细胞变异。Mair等[32]通过对胶质母细胞瘤患者来源的原位移植异种移植模型中的循环核酸进行微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）检测和靶向捕获测序发现，与肿瘤来源的cf-nDNA相比，肿瘤来源的cf-mtDNA的血浆检测率更高，并且允许在脑脊液和尿液中检测，表明与cf-nDNA相比，cf-mtDNA可更敏感地检测和监测患者来源的胶质母细胞瘤原位异种移植瘤的肿瘤负荷。Campo等[33]通过超深度测序检测个体cf-mtDNA突变的核苷酸位置的遗传异质性，而不检测特定的突变，并利用机器学习算法建立模型，能够有效区分肝癌患者与健康对照，准确率高达99.78%。Guo等[34]针对cf-mtDNA展开深入研究，开发了一系列cf-mtDNA精准分析流程，包括评估血浆样品cf-mtDNA突变检测中剪切、定位和过滤等关键分析程序，建立了一种创新的数据分析平台；同时也开发了一种基于随机森林机器算法的模型，用于准确识别样本交叉污染，评估污染水平并检测污染来源的变异位点，可有效提高突变检测的准确性和灵敏度[35]。此外，Guo等[36]基于随机森林算法还开发了一种无对照情景下识别mtDNA突变来源的工具 （mitoSomatic），用于准确区分肿瘤组织、癌旁非肿瘤组织中mtDNA体细胞突变和遗传变异。综上所述，cf-mtDNA突变与肿瘤之间存在密切的关系，因此cf-mtDNA突变可能成为肿瘤的分子标记，通过对cf-mtDNA突变进行检测识别，有望在早期肿瘤诊断、治疗反应性的预测及肿瘤治疗方案的制定上提供有力的支持和指导。

3 cf-mtDNA片段组学

液体活检不仅限于检测cf-mtDNA的遗传学和表观遗传学的改变，cf-mtDNA的片段信息同样具有重要作用，主要包括片段大小、片段末端碱基基序、片段断点碱基基序等特征，这一研究领域被称为cfmtDNA片段组学，其所涵盖的生物学信息在肿瘤诊断、组织溯源等方面具有潜在的应用价值。近年来，研究人员越来越多地关注cf-mtDNA片段组学特征与肿瘤之间的关系。2019年，剑桥大学的Richard研究团队通过胶质母细胞瘤患者来源的原位移植瘤小鼠模型检测到血浆中肿瘤来源的DNA主要集中在145 bp，比正常cfDNA片段偏短，研究还发现检测血浆中肿瘤mtDNA比ctDNA在胶质母细胞瘤早期检测中更灵敏[32]。除了片段大小，Jiang等[37]研究发现肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者血浆DNA的CCCA末端碱基基序的丰度远低于非HCC患者。该现象可能与脱氧核糖核酸酶1、脱氧核糖核酸酶1L3、DNA片段化因子亚基β切割cfDNA有关[38]。提示，cf-mtDNA片段特征和拷贝数的差异可用于区分癌症患者和非癌症人群。同时，Li等[8]发现，与血浆cf-mtDNA相比，外泌体中mtDNA具有更大的片段分布，与HCC患者和健康对照相比，肝炎患者外泌体中mtDNA具有更长的片段分布。上述研究表明，通过对cf-mtDNA片段组学特征的检测和分析，获得一些肿瘤特定的片段特征，为肿瘤的病理分子机制和治疗靶点的探索提供思路和方向。此外，包括末端碱基序列、断点碱基序列在内的cf-mtDNA片段组学其他特征在肿瘤诊断中的价值有待进一步挖掘，肿瘤患者cf-mtDNA片段化机制有待深入研究。

4 cf-mtDNA多组学联合

随着液体活检相关研究的不断深入，cf-mtDNA检测技术不断发展，多组学联合分析成为一种新的趋势。Zhou等[39]基于长片段PCR扩增（long range PCR，LR-PCR） 与3对mtDNA特异性扩增引物联合6对nDNA特异性扩增引物建立了mtDNA与内参nDNA同时杂交捕获探针的制备方法。基于此，建立了mtDNA拷贝数、突变、片段组学同时检测方法。利用该方法，Zhou等[39]发现HCC患者血浆cfmtDNA拷贝数显著低于组织中mtDNA拷贝数，而cf-mtDNA片段短于cf-nDNA片段；成功检测到血浆cf-mtDNA中肿瘤特异性mtDNA突变的一部分，特别是来自HCC患者的血浆cf-mtDNA，同时证明血浆样本中存在大量潜在的癌症特异性mtDNA突变。此外，另一项研究发现，与血浆相比，尿液cf-mtDNA拷贝数更高、片段更长。与健康对照、良性疾病患者相比，肿瘤患者尿液cf-mtDNA中短片段（＜150 bp）的占比显著升高。尿液cf-mtDNA短片段的富集分析能够显著增强mtDNA体细胞突变检测。尿液和血浆cf-mtDNA之间片段末端的碱基占比不同且与片段大小有关。通过整合尿液cf-mtDNA的片段组学和突变特征，可以构建出有效区分健康对照与肿瘤患者的诊断模型[40]。目前仍需更多研究证明cf-mtDNA含量、片段组学和突变特征在肿瘤诊断中的临床实用性。

5 血浆环状cf-mtDNA

近几年，关于血浆中环状mtDNA的报道也日益增多。Newell等[41]使用mtDNA重叠片段的特异性PCR引物扩增血浆游离DNA，证实了血浆中完整mtDNA的存在。随后，Ma等[6]使用限制性内切酶BfaI切割mtDNA以区分线性和环状mtDNA，两端携带BfaI切割特征的mtDNA片段被定义为环状mtDNA，而没有切割特征或具有1个切割特征的mtDNA片段被定义为线性mtDNA；研究还发现血浆中同时存在线性mtDNA与环状mtDNA。有关环状cf-mtDNA是否与线性cf-mtDNA有不同的产生机制尚未见报道。环状cf-mtDNA的来源是否具有肿瘤特异性，特征是否能够发挥肿瘤诊断价值有待进一步探索和挖掘，成熟稳定的环状及线性cfmtDNA同时检测技术有待进一步建立。

6 结语与展望

目前，越来越多研究结果表明，cf-mtDNA作为新型生物标志物在癌症检测方面发挥重要作用，对于延长患者生存期十分关键。尽管液体活检技术在癌症管理方面拥有较好的前景，但只有少数相关技术已被批准用于临床，究其原因可能是：1）总体上对cf-mtDNA的生物学特性及释放机制的理解存在不足；2）肿瘤来源的cf-mtDNA浓度较低，易被来自其他细胞的非信息性cf-mtDNA所掩盖；3）目前提出的液体活检技术存在检测成本高、操作难度大、检测周期长的局限性，可行性不高[42]。cfmtDNA作为新型生物标志物能够提供的肿瘤信息在肿瘤早期诊断、治疗监测、耐药性评估、预后预测方面极具应用潜力。随着精准检测技术的不断发展和临床研究的逐渐深入，如单细胞测序技术、转录组分析以及长读长测序的技术发展，能够更精准、更全面、更成本合理地检测分析cf-mtDNA特征，促进基于cf-mtDNA的多组学特征检测的肿瘤诊断作为常规检查在肿瘤管理中的应用。同时，多组学联合检测的运用使得更多特征整合分析，有助于更全面地获得相关肿瘤信息，具有提高癌症检测的灵敏度和临床应用的潜力[43]。机器学习的发展为基于cf-mtDNA检测技术的精准诊疗带来巨大机遇。机器学习通过选取合适的算法，从数据中自动归纳逻辑或规则，并根据归纳结果构建预测模型[44]。近年来，机器学习算法被广泛应用于肿瘤来源特征识别[45]，极大地提高了检测技术的灵敏性和特异性，助力肿瘤的精准诊疗。此外，需进一步聚焦于临床研究，以证明cf-mtDNA在肿瘤管理中的实际应用价值，并为未来的个性化医疗开辟新的途径。