复方血竭跌打膏的制剂工艺、指纹图谱及含量测定研究＊

郭星妤，俞越童，崔述生，孙 波，翟恩爱，于淑琳，邹慧琴＊＊，闫永红＊＊

（1. 北京中医药大学中药学院 北京 102401；2. 中国中医科学院中药研究所 北京 100700；3. 北京市鼓楼中医医院 北京 100009）

复方血竭跌打膏由血竭、乳香、没药等十味中药配伍组成，原方为崔氏速效损伤灵药膏，来源于北京市鼓楼中医医院，是国家级名老中医、首都名中医崔述生教授在长期临床实践中研发出的用于治疗急性软组织损伤的验方，临床疗效确切。随着使用需求不断扩大，由蜂蜜混合、现用现配制成的糊剂已无法满足临床使用及药品存储需求。水包油型（O/W）乳膏剂能够较好的分散树脂类油溶性药物和水溶性药物，具有容易涂布、无油腻感、便于清洗的优点，更适合本制剂的临床使用需求[1]。传统的中药质量评价方法包括定性鉴别与含量测定，而中药复方制剂具有多成分、多靶点、协同作用发挥疗效的特点，其质量评价标准要针对多成分测定、全过程评价[2]。

课题组前期已完成对原料药的提取工艺优化[3]，本研究在中医药理论指导下结合现代制剂技术，制备出工艺稳定、质量可控的复方血竭跌打膏，建立了HPLC 指纹图谱并测定了三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及川续断皂苷Ⅵ含量，以期为复方血竭跌打膏临床扩大使用提供安全可靠的保障，并促进临床验方从“方”向“药”的发展[4]。

1 材料

1.1 仪器

AK20002 电子天平（成都倍赛克仪表研究所）；电风鼓吹干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州恒岩仪器有限公司）；BY-400C 型医用离心机（北京白洋医疗器械有限公司），Waters e2695 高效液相色谱仪（Waters 2489 PDA 检测器，美国）；Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱（4.6×250 mm，5 µm）；FW-100 高速万能粉碎机型（北京科伟永兴仪器有限公司）；HH-S6A电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；KQ-500DE 数控超声波清洗；RE-52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药

血竭（批号：1806002）、乳香（批号：1805002）、没药（批号：1805002）、续断（批号：1801006）、三七（批号：1804001）、延胡索（批号：1806003、210912）、红花（批号：1805004、201214001、210613001）、青黛（批号：1805002）、骨碎补（批号：1806001、180101、1906030），鹿筋购自安国兴华药业有限公司。硬脂酸，硬脂醇，白凡士林，羊毛脂，单硬脂酸甘油酯，液体石蜡，甘油，三乙醇胺，十二烷基硫酸钠，尼泊金乙酯，吐温80均为药用辅料；柚皮苷对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：5562），延胡索乙素对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：5066），血竭素高氯酸盐对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：Y17M9H56341），人参皂苷Rg1对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：G16S10Y97436）；人参皂苷Rb1对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：7672）；三七皂苷R1对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：5365）；川续断皂苷Ⅵ对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：5688）；甲醇、正丁醇、氨水、无水乙醇均为分析纯；乙腈为色谱纯；娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 乳膏剂制备工艺

2.1.1 处方基质筛选

以软膏的均匀度、细腻度、稠度、涂展性、有无气泡、油腻性等6方面为外观性状评价指标；以膏体是否发粗、有无油水分离两方面为高、低温实验评价指标；以有无出现油水分离、药物沉淀两方面为离心实验评价指标[5-8]，筛选最优处方[9-11]，评分结果见表1。初步定为处方7：硬脂酸10 g、液体石蜡7 g、单硬脂酸甘油酯5 g、羊毛脂2 g、白凡士林6 g、十二烷基硫酸钠1 g、甘油10 g。具体制法为：将硬脂酸、液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、羊毛脂，置于烧杯中水浴加热至熔融，油相备用；再取十二烷基硫酸钠、甘油、水，置于烧杯中水浴加热至溶解，水相备用；分别加入浓缩药液，将水相加入油相乳化，加入药物极细粉搅拌均匀，即得。

表1 基质处方筛选结果

2.1.2 基质配比优化

（1）单因素实验考察基质用量

采用单因素实验考察硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸钠等基质的用量，确定星点设计实验的因素和水平，单因素实验考察因素与水平见表2。此外，由于白凡士林∶液体石蜡的用量对药膏离心稳定、耐寒耐热性影响较大，故对二者比例进行考察。

表2 单因素考察因素与水平

实验结果显示：甘油用量为10 g 时综合评分最高；白凡士林:液体石蜡用量为3 g∶6 g 时，外观性状和稳定性都较好，综合评分最高。而硬脂酸用量在10 g、15 g 综合评分最高；单硬脂酸甘油酯用量在3 g、6 g 综合评分最高；十二烷基硫酸钠用量在1 g、2 g 综合评分最高；羊毛脂用量在1 g、3 g综合评分最高。综上，固定100 g 处方中，白凡士林用量为3 g，液体石蜡用量为6 g，甘油用量为10 g，选择硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸钠、羊毛脂四项为响应面考察因素，用星点设计-效应面法（CCD-RSM）优化处方基质配比。

（2）CCD-RSM优化处方基质配比

参考文献[12-14]，根据单因素考察结果，采用designexpert 8.0.6软件设计实验方案和处理数据结果。因素水平表见表3，响应面实验方案与结果见表4。

表3 CCD实验因素的代码水平及其对应的物理量

表4 CCD实验方案与结果

将表4 中的实验结果用design expert 8.0.6 软件处理，得到方差分析结果，见表5，同时进行回归方程拟合，得到二次回归方程：Y=46.33-1.88A+5.37B-1.79C-1.21D-0.94AB+0.81BC+0.063AD+0.81BC+1.56BD-0.19CD-2.53A2-0.66B2-0.16C2-0.78D2（R2=0.9414，P＜0.0001）。根据拟合出的二次回归方程，采用design expert 8.0.6软件进一步做出各因素间交互作用的三维响应面图，见图1。

图1 交互作用响应面图

表5 响应面方差分析表

拟合方程的相关系数R2=0.9414，表明模型预测值与实测值有较高的关性，回归方程拟合度好，预测性好；由表4 方差分析可知，拟合出的模型P＜0.0001，说明模型具有显著性；模型的失拟项P=0.1461＞0.05，不具有显著性，表明回归方程拟合较好，可用于本实验的处方基质配比优化。由各因素的F值可以比较出四个因素对药膏成型的影响显著性顺序为：B＞A＞C＞D，A、B、C、D 四个因素的P值均小于0.05，表明四个因素都具有显著影响，交互作用中BD 有显著影响，其余交互作用无显著影响。

采用design expert 8.0.6软件在使综合评分最大情况下，得到最佳基质用量为：硬脂酸10.7 g、单硬脂酸甘油酯6.0 g、十二烷基硫酸钠1.0 g、羊毛脂3.3 g。

（3）验证实验

按确定的最佳基质配比条件平行制备出三批复方血竭跌打膏，对软膏的外观性状、高温实验、低温实验、离心实验进行综合评分，结果见表6。由表6可知，相对误差为2.66%，说明实测值与预测值偏差较小，拟合出的模型具有良好的预测性，优选出的最佳基质配比科学合理，稳定可行。

表6 验证实验结果

2.2 指纹图谱

2.2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱（4.6×250 mm，5 µm）；流动相水（A）-乙腈（B）梯度洗脱条件见表7；检测波长283 nm；进样量10 µL；柱温40℃；流速1.0 mL·min-1。

表7 HPLC梯度洗脱程序表

2.2.2 供试品的制备

称取5 g 药膏，加30 mL 甲醇超声（250 W，频率40 KHz）提取30 min，放冷后过滤，取续滤液过0.22 µm微孔滤膜，即得。

2.2.3 HPLC指纹图谱的建立

（1）方法学考察

精密度实验结果显示，取样品（0519）制备1份供试品溶液，连续进样6针，以最高峰为参照，测得峰面积大于80000的共有峰相对保留时间RSD＜0.62%，相对峰面积RSD＜4.84%，表明仪器精密度良好。重复性实验结果显示，取样品（0519）平行制备6 份供试品溶液，以最高峰为参照，同样标准测得共有峰相对保留时间RSD＜0.15%，相对峰面积RSD＜4.62%，表明该方法重复性良好。稳定性实验结果显示，取样品（0519）制备1份供试品溶液，分别于0、6、12、18、24 h进样，以最高峰为参照，同样标准测得共有峰相对保留时间RSD＜0.47%，相对峰面积RSD＜4.17%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

（2）图谱生成

取11 批样品，按3.2.2 项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1 项下色谱条件检测，将处理结果保存cdf. 格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012”，得到19 个共有峰，相似度均＞0.9，且对峰进行归属结果如图2所示。

图2 11批样品的HPLC指纹图谱

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱（4.6×250 mm，5 µm）；流动相水（A）-乙腈（B）梯度洗脱（0-30 min，81%-80% A；30-60 min，80%-62% A）；检测波长203 nm；进样量10 µL；柱温30℃；流速1.0 mL·min-1。

2.3.2 溶液的制备

（1）混合对照品溶液的制备

精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷Ⅵ对照品适量，用甲醇溶解定容至10 mL 容量瓶中，配制成浓度分别为0.978、1.447、1.528、2.087 mg·min-1的混合对照品溶液。

（2）供试品溶液的制备

称取20 g 药膏，加50 mL 甲醇超声（250 W，频率40 KHz）提取1 h，放冷后过滤，蒸干滤液，加20 mL 水溶解残渣，用水饱和正丁醇萃取2 次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2 次，每次30 mL，取正丁醇液，蒸干，加甲醇溶解残渣定容至5 mL 容量瓶中，过0.22 µm微孔滤膜，取续滤液，即得。

（3）阴性样品溶液的制备

按复方血竭跌打膏处方及工艺制备缺三七药膏和缺续断药膏，同“2.3.2（2）”项下供试品溶液制备方法制成缺三七阴性样品溶液和缺续断阴性样品溶液。

2.3.3 系统适用性实验

专属性考察结果显示，混合对照品溶液、供试品溶液、缺三七阴性样品溶液、缺续断阴性样品溶液色谱图分离度良好、阴性无干扰，见图3。线性关系考察结果显示，三七皂苷R1在48.9-978.0 µg·mL-1、人参皂苷Rg1在72.4-1447.0 µg·mL-1、人参皂苷Rb1在76.4-1528.0 µg·mL-1、川续断皂苷Ⅵ在104.4-2087.0 µg·mL-1范围内相关系数r＞0.999。精密度实验结果显示，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷Ⅵ的峰面积RSD 分别为1.54%、1.23%、1.14%、0.72%，表明仪器精密度良好。稳定性实验结果显示，24 h 内三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷Ⅵ含量的RSD 值分别为1.91%、1.98%、1.96%、1.99%，表明溶液24 h 内稳定。重复性实验结果显示，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷Ⅵ含量的RSD 值分别为1.78%、1.71%、1.97%、1.79%，表明此方法重复性良好。加样回收率实验结果显示，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷Ⅵ的平均加样回收率分别为99.64%、99.81%、100.84%、98.83%，RSD 值分别为2.22%、2.69%、3.16%、2.45%，表明此方法回收率良好。

图3 高效液相色谱图

2.3.4 中试样品的含量测定

取三批中试药膏，按上述建立的含量测定方法进行含量测定，分别计算每克药膏中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷Ⅵ的含量。结果显示，药膏中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷Ⅵ的平均含量分别为41.48 µg·g-1、200.08 µg·g-1、199.37 µg·g-1、150.45 µg·g-1，可为后续制定质量标准提供参考。

3 讨论

复方血竭跌打膏药味复杂，方中乳香、没药等树脂类药物主要成分为油脂性，红花、续断等的提取物为水溶性，通过预实验发现乳剂型基质能更好的溶解分散原料药物。而一般认为O/W 型乳膏较W/O 型乳膏药物释放和透皮吸收快[15]，更适合本制剂的临床使用需求，因此将其制备为O/W 型乳膏。CCD-RSM 是一种通过建立多元二次回归模型来拟合自变量与效应变量之间的函数关系，对获得的函数模型分析得出最佳实验条件的统计方法[16]，具有实验精度高、预测性好、实验简单等优点[17-18]。因此，本实验选择CCDRSM 对处方基质配比进行优化，建立的多元二次回归方程拟合度好，并通过验证表明优选出的基质处方稳定可靠。

中药复方制剂多成分协同发挥疗效，指纹图谱综合全面的特点更有利于科学实际的建立制剂质量评价标准[19]，同时能反应复方制剂质量的稳定性与一致性[2]。本实验分别比较了100%甲醇、80%甲醇、50%甲醇的提取效率以及30℃、35℃、40℃柱温对色谱图的影响，通过全波长扫描，选择出峰最多、分离度最好的检测波长，确定了最终的色谱条件。基质中加入的防腐剂尼泊金乙酯在该检测条件下出峰，且响应值最大，但由于该峰对其他峰干扰较小且在其他检测波长下的分离效果并不理想，而基质中的其他成分对色谱图无影响，综合考虑将尼泊金乙酯纳入指纹图谱的建立。由于本复方药味复杂，指纹图谱并未涵盖所有成分，因此进一步对处方当中的臣药续断以及贵重药三七的皂苷成分进行定量分析，为建立质量标准提供参考。本研究在建立三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷Ⅵ的含量测定方法时，比较了波长为190 nm、203 nm、212 nm时色谱峰的分离效果，结果4个成分在203 nm时基线较稳定，峰型较好且分离度良好，因此选择检测波长为203 nm。在预实验中拟同时测定人参皂苷Re 的含量，但由于测定时发现人参皂苷Re 含量较少，色谱峰面积小且不稳定，因此不予考虑。

综上，本实验制备的复方血竭跌打膏均匀细腻、易于涂布、质量稳定，指纹图谱结果显示制剂工艺稳定可行，后续将在上述实验基础上开展透皮实验，继续完善对本复方的临床前研究。