氯化钙处理对发芽绿豆营养品质和抗氧化能力的影响

靳晓琳,贾易天,张小梅,回传胤,田小雨,侯银臣,张一鸣

1(河南牧业经济学院 食品与生物工程学院,河南 郑州,450046) 2(郑州工程技术学院 化工食品学院,河南 郑州,450044)

绿豆又名植豆,在我国有悠久的种植历史,可药食兼用,富含蛋白质、碳水化合物和膳食纤维[1]。绿豆芽菜是一种传统的芽菜食品,因其口感脆嫩而深受人们喜爱,绿豆在发芽过程中为维持生长需要,高分子蛋白、碳水化合物会在自身酶的作用下开始降解,形成小分子的生理活性物质,因而与绿豆相比,绿豆芽菜更易于被人体消化吸收。发芽豆类还含有多种抗氧化成分,可降低人体血糖和血压、软化血管、增强肌体免疫力,还能有效地将细胞中泄漏出来的多余活性氧清除掉,从而保护细胞和组织免遭氧化伤害,具有抗癌和抗衰老的功效[2]。

Ca2+是植物生长和发育过程中的重要调控者,尤其是调控植物生理代谢及加速发芽过程中的生化反应[3],Ca2+可激活机体内多种酶、提高淀粉酶活性,增强质膜透性,强化种子活力,在种子萌发过程中起重要作用[4-5]。适宜浓度的Ca2+能促进芽菜生长,缩短芽菜生产周期,提高营养品质,有研究表明,钙能显著促进青蒜苗生成可溶性糖、维生素C以及大蒜素[6]。陈士林等[7-8]研究发现钙能显著提高玉米、棉花种子的发芽势,促进胚芽伸长,此外,外源Ca2+处理导致芽菜中的酚类物质及其抗氧化活性增强[9-10]。目前,外源钙已经被用于农产品保鲜,在果蔬生长季节和采后阶段及时地补钙,可提高园艺产品的保质期和营养品质。然而,有关钙对绿豆芽菜营养品质和抗氧化能力的影响则很少受到关注。

本研究使用不同浓度的钙离子处理绿豆芽菜,就豆类在发芽过程中主要营养成分和抗氧化能力的变化规律进行研究,探索最适宜的发芽时间和施钙浓度,为绿豆芽的工业化生产和豆类的深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿豆种子:豫绿2号,购于河南省郑州市秋乐种业,于-20 ℃贮存备用。DPPH、2,4,6-三吡啶基三嗪[2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine,TPTZ]、抗坏血酸、儿茶素,美国Sigma公司;牛血清白蛋白、福林-酚试剂、矢车菊素-3-葡萄苷,北京索莱宝科技有限公司;甲醇(色谱纯),天津市康科德科技有限公司;盐酸、硫酸、乙醇、草酸、硫酸亚铁、碳酸钠等(均为分析纯),国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilgent 1200高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;PGX-150智能培养箱,宁波海曙塞福实验仪器厂;康丽A370豆芽机,佛山市顺德区嘉壕实业有限公司;PYX-DHS-BS型隔水电热恒温培养箱,上海跃进医疗器械厂;818型pH计,美国Orion公司;Multiskan FC型酶标仪,上海赛默飞世尔仪器有限公司;UV-2802型紫外-可见分光光度计,上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 氯化钙浓度处理

设置3个浓度梯度的CaCl2溶液,分别为0.5、2、5 mmol/L,以蒸馏水作为对照(CK),共4个处理。称取40 g籽粒饱满的绿豆种子,使用1.0%(体积分数)的次氯酸钠溶液浸泡15 min后,使用蒸馏水中漂洗至pH中性,在恒温培养箱中30 ℃浸泡4 h,然后放置到发芽机中30 ℃黑暗培养4 d。每隔12 h更换喷淋溶液,发芽机每1 h喷淋一次培养液,每次2 min。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 芽长和呼吸速率测定

随机选取20株绿豆芽菜,用游标卡尺测定其芽长。

参照李海霞等[11]的方法,利用改良的小篮子法测定绿豆芽菜的呼吸速率,呼吸速率表示为mg CO2/(g·h)。

1.3.2.2 可溶性蛋白和游离氨基酸测定

分别采用考马斯G-250染色法[12]和茚三酮显色法[13]测定。

1.3.2.3 可溶性糖和总糖测定

总糖和可溶性糖参照张述伟等[14]的方法并稍作修改,总糖的提取:称取0.5 g绿豆芽菜,加入10 mL 6 mol/L HCl和15 mL蒸馏水,沸水浴中加热2 h后定容至25 mL,上清液即为提取液。可溶性糖的提取过程将6 mol/L HCl替换成蒸馏水,其余步骤同总糖的提取。取上述1.0 mL上清液依次加入0.5 mL蒽酮试剂和4.0 mL浓硫酸,充分振荡,立即放入沸水浴,保温1 min后自然冷却至室温于620 nm下测定吸光度。

1.3.2.4 总酚含量测定

参照SUN等[15]的方法并稍作修改,选取1.0 g绿豆芽菜粉,加入50 mL 1.0%(体积分数)盐酸甲醇溶液作为提取液,30 ℃下超声30 min,提取液于3 000×g离心15 min,收集上清液,将沉淀按上述过程二次提取后合并上清液,每个样品平行3次提取。取0.25 mL上清液,先加1.0 mL 0.2 mol/L福林酚试剂,再加入2.0 mL 2.0% Na2CO3溶液,在25 ℃下进行暗反应90 min,最后在765 nm处测定吸光度值。

1.3.2.5 总黄酮含量测定

参考SUN等[15]的方法并稍作修改,用儿茶素为标准品制作标准曲线。提取方法同总酚含量的测定。取0.3 mL上清液,先加1.5 mL蒸馏水和0.09 mL质量分数为5.0%的NaNO2溶液,充分混匀后静置5 min,再加0.18 mL质量分数为10%的Al(NO3)3溶液,混匀,静置6 min;最后再加入0.6 mL 1 mol/L NaOH溶液和0.33 mL蒸馏水,在510 nm处测定。

1.3.2.6 总花青素含量测定

总花青素的含量参照刘婷婷等[2]方法进行测定,结果以矢车菊素-3-葡萄苷当量表示(mg/g样品)。

1.3.2.7 抗坏血酸含量测定

抗坏血酸含量测定参照SUN等[15]的方法进行测定。

1.3.2.8 DPPH自由基清除率测定

参考陈金祥等[16]的方法稍做改进,称取1.0 g豆芽,加入8 mL体积分数为50%甲醇溶液进行研磨提取,于8 000×g离心10 min,取1.0 mL上清液,依次加入0.5 mL 0.4 mmol/L DPPH无水乙醇溶液,再加2.0 mL蒸馏水,混匀,避光反应30 min后,在517 nm处测定吸光值。清除率的计算如公式(1)所示:

(1)

式中:A0为对照实验(水代替样品溶液)的吸光值;A1为样品实验的吸光值;A2为样品干扰实验(无水乙醇代替DPPH溶液)的吸光值。

1.3.2.9 亚铁还原能力测定

根据SUN等[15]的方法稍加修改,分别吸取0.1 mL浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8,1.0 mmol/L的FeSO4标准液,加入3.0 mL FRAP工作液[25 mL 0.3 mol/L的醋酸盐缓冲液(pH 3.6)+2.5 mL 10 mmol/L TPTZ溶液+2.5 mL 20 mmol/L FeCl3混合而成,现用现配],再加入0.3 mL蒸馏水,混匀,于37 ℃下准确反应4 min后于593 nm处测定其吸光度,绘制标准曲线。然后取0.1 mL样品提取液依次加入3.0 mL FRAP工作液和0.3 mL蒸馏水,混匀,37 ℃准确反应4 min后,于593 nm处测定其吸光度,样品的抗氧化活性以达到相同吸光度所需FeSO4的毫摩尔数表示。

1.4 数据处理与统计分析

进行3次生物学重复,实验数据以X±SD表示,利用SPSS 19.0进行数据统计分析,在0.05水平进行显著性分析。采用Person相关分析对样品的总酚含量、总黄酮、抗坏血酸含量与DPPH自由基清除能力和亚铁还原能力进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 氯化钙处理对发芽绿豆芽长的影响

由图1可知,在发芽4 d内,与对照和其他浓度氯化钙处理相比,外源喷淋2 mmol/L氯化钙下绿豆芽长有显著提高(P<0.05),在发芽第4天,芽长是对照的1.31倍,而5 mmol/L的氯化钙生长最慢,在发芽第4天芽长较对照降低了23.96%(P<0.05)。此外,除发芽1～2 d外,0.5 mmol/L氯化钙处理下绿豆芽长均显著高于对照(P<0.05),而在发芽1～2 d与对照无显著差异(P>0.05)。由此可见,这表明低浓度的钙有促进绿豆芽菜生长的作用,而高浓度钙则起抑制作用。

图1 氯化钙处理对发芽绿豆芽长的影响

2.2 氯化钙处理对发芽绿豆呼吸速率的影响

由图2可知,绿豆芽菜在生长过程中呼吸速率不断增强,在发芽第4天达到最大(P<0.05),其中,0.5 mmol/L 和2 mmol/L氯化钙处理下呼吸速率表现出相似的促进作用,在发芽第4天分别为对照的1.22 和1.37倍(P<0.05),而5 mmol/L氯化钙处理下呼吸速率在发芽4 d内均显著低于对照(P<0.05)。

图2 氯化钙处理对发芽绿豆呼吸速率的影响

2.3 氯化钙处理对发芽绿豆可溶性蛋白含量的影响

由图3可知,在发芽4 d内,发芽绿豆中可溶性蛋白均呈先上升后下降趋势,在发芽第3天达到最大(P<0.05)。其中在发芽第3天,0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化钙处理下可溶性蛋白显著高于对照,分别较对照增加了11.7%和8.8%(P<0.05),而在发芽第4天,与对照相比无显著性差异(P>0.05)。0.5 mmol/L氯化钙处理下的可溶性蛋白含量在发芽4 d内均显著低于对照(P<0.05)。

图3 氯化钙处理对发芽绿豆可溶性蛋白含量的影响

2.4 氯化钙处理对发芽绿豆游离氨基酸含量的影响

由图4可知,发芽绿豆中游离氨基酸含量随时间延长而增加(P<0.05),2 mmol/L氯化钙处理下游离氨基酸含量最高,分别为对照的1.65、2.05、1.76和1.35倍(P<0.05)。同时,除发芽第1天外,0.5 mmol/L氯化钙处理下游离氨基酸含量均显著高于对照(P<0.05),而5 mmol/L氯化钙处理下游离氨基酸含量在发芽2～4 d均显著低于对照(P<0.05)。

图4 氯化钙处理对发芽绿豆游离氨基酸含量的影响

2.5 氯化钙处理对发芽绿豆总糖含量的影响

由图5可知,随着时间的延长,发芽绿豆中总糖含量先升高后逐渐降低,在发芽第2天达到最大值(P<0.05)。与对照和其他氯化钙处理相比,2 mmol/L氯化钙处理下总糖含量在发芽1～3 d显著提高(P<0.05)。在发芽第4天,5 mmol/L氯化钙处理下总糖含量显著低于其他氯化钙处理(P<0.05),但与对照相比无显著性差异(P>0.05)。

2.6 氯化钙处理对发芽绿豆可溶性糖含量的影响

由图6可知,绿豆芽菜中可溶性糖含量随时间延长而增加(P<0.05),其中在发芽第4天,0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化钙处理下可溶性糖含量显著高于对照,分别增加11.78%和18.38%(P<0.05),5 mmol/L氯化钙处理下与对照相比无显著性差异(P>0.05)。

图6 氯化钙处理对发芽绿豆可溶性糖含量的影响

2.7 氯化钙处理下发芽绿豆总酚含量的变化

由图7可知,绿豆芽菜中总酚含量在发芽1～4 d均呈增加趋势(P<0.05),在发芽第4天,2 mmol/L氯化钙处理下的总酚含量最高,达到10.47 mg/g(P<0.05),其次是0.5 mmol/L、对照和5 mmol/L氯化钙处理,其中0.5 mmol/L氯化钙处理下绿豆芽菜中的总酚含量,与对照相比无显著性差异(P>0.05)。

图7 氯化钙处理对发芽绿豆总酚含量的影响

2.8 氯化钙处理下发芽绿豆总黄酮含量的变化

图8表明绿豆芽菜中总黄酮含量变化趋势和总酚类似,均在发芽4 d内显著增加,其中,除发芽2 d外,氯化钙处理下总黄酮含量均显著高于对照(P<0.05)。在发芽第4天,0.5、2、5 mmol/L氯化钙处理下的总黄酮分别比对照增加了15.95%、33.62%和7.89%(P<0.05)。

图8 氯化钙处理对发芽绿豆总黄酮含量的影响

2.9 氯化钙处理下发芽绿豆总花青素含量的变化

由图9可知,在发芽4 d内,5 mmol/L氯化钙处理的总花青素含量呈持续增加趋势,而对照和其他2个浓度氯化钙处理下总花青素含量表现出相似的变化趋势,即在发芽3 d达到最大值(P<0.05)。同时,在发芽4 d内,0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化钙处理下总花青素含量显著高于对照,而5 mmol/L氯化钙处理的总花青素仅在发芽第4天显著高于对照,为对照的1.52倍(P<0.05)。此外,在发芽第4天,氯化钙处理下的总花青素含量均显著高于对照(P<0.05),但三者间无显著性差异(P>0.05)。

图9 氯化钙处理对发芽绿豆总花青素含量的影响

2.10 氯化钙处理下发芽绿豆抗坏血酸含量的变化

由图10可知,在发芽4 d内,处理下的抗坏血酸含量均呈上升趋势,其中在发芽1～2 d增加缓慢,在2～4 d急剧增加。此外,3个浓度氯化钙处理均显著增加绿豆芽菜中抗坏血酸含量(P<0.05),在发芽第4天,0.5、2、5 mmol/L氯化钙处理下抗坏血酸含量分别较对照增加了15.8%、27.1%和23.8%,然而这3个浓度间含量无显著性差异(P>0.05)。

图10 氯化钙处理对绿豆芽菜抗坏血酸含量的影响

2.11 氯化钙处理下发芽绿豆DPPH自由基清除能力的变化

由图11可知,在萌发过程中氯化钙处理显著提高了绿豆芽菜DPPH自由基清除能力,萌发时间、喷淋处理及其交互作用对清除能力有显著影响(P<0.05),在发芽第4天,2 mmol/L氯化钙处理下清除能力最高,其次为5、0.2 mmol/L氯化钙和对照处理(P<0.05)。

图11 氯化钙处理对发芽绿豆DPPH自由基清除率的影响

2.12 氯化钙处理下发芽绿豆亚铁还原能力的变化

发芽期间,处理和对照的亚铁还原能力显著增加,其中2 mmol/L氯化钙处理下还原能力最高(P<0.05)(图12)。0.5 mmol/L氯化钙在发芽2～4 d显著高于对照,在发芽第1天无显著性差异(P>0.05),而5 mmol/L氯化钙仅在发芽3～4 d显著高于对照。在发芽第4天,0.5、2、5 mmol/L氯化钙处理下还原能力分别较对照增加了62.7%、74.0%和6.5%(P<0.05)。

图12 氯化钙处理对发芽绿豆亚铁还原能力的影响

2.13 氯化钙处理下发芽绿豆抗氧化成分与抗氧化性能的相关关系

DPPH自由基清除能力、亚铁还原能力是目前衡量植物抗氧化性常用的指标。由表1可知,绿豆芽苗菜的DPPH自由基清除能力变化与亚铁还原能力的相关系数为0.718,达到显著水平,这说明这2种方法可以基本一致的反映不同发芽时期绿豆芽菜提取液的抗氧化活性。绿豆芽菜中总酚含量、总黄酮、抗坏血酸含量与DPPH自由基清除能力和亚铁还原能力呈显著相关(P<0.05)。总花青素与DPPH自由基清除能力和亚铁还原能力间的相关性不显著(P>0.05)。

表1 绿豆芽菜中总酚、总黄酮、原花青素和抗坏血酸含量与抗氧化活性之间的相关性

3 讨论与结论

呼吸是种子萌发过程中胚芽的基础生理代谢活动,种子中各种水解酶的合成和激活以及物质转化都跟呼吸密切相关,Ca2+通过钙结合蛋白调节种子萌发过程中的一些代谢酶,提高胚和胚乳中淀粉酶等水解酶的活性,用Ca2+处理糙米种子其呼吸速率有显著提高[17],同时钙元素是植物细胞的结构组成元素,适当补充钙元素可促进芽菜的生长[10],本研究的结果也证实了这一点,绿豆籽粒发芽期间经0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化钙处理,其芽长和呼吸速率均显著上升,干物质消耗增加,表明发芽绿豆的生命活动受到氯化钙处理,物质代谢速度加快,其中2 mmol/L氯化钙的促进作用最强,而高浓度氯化钙(5 mmol/L)对芽菜生长有抑制作用,在发芽初期高强度的呼吸速率与种子高活力密切相关[18],从而更快地为细胞合成提供还原力及中间代谢产物。

绿豆作为一种高蛋白、中淀粉、低脂肪的豆类,在发芽期间,贮藏物质水解释放出大量的能量,转化成易吸收的可溶性低分子物质,本研究中,在发芽4 d内,绿豆芽菜总糖和可溶性蛋白含量均呈先上升后下降趋势,这可能是发芽后期消耗增加,而淀粉和贮藏蛋白水解补给有限,因而出现下降趋势[19-20]。绿豆在发芽过程中,随着淀粉酶、葡萄糖磷酸化酶等水解酶活力的提高,总糖不断地被降解,可溶性糖含量增加。同样,蛋白质在蛋白水解酶的作用下降解成氨基酸,游离氨基酸显著增加,这种变化趋势与陈志刚等[21]对糙米的研究结果一致。本研究发现0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化钙处理显著提高可溶性糖和总糖含量,这与王艳颖等[22]在鲜切芹菜的研究结果相似,这可能是适宜的钙能够促进淀粉水解及脂类的分解转化,从而使糖类增加[23]。

黄酮和酚类物质具有较好的自由基清除能力,是近年来天然抗氧化剂研究的热点之一。苯丙氨酸解氨酶作为苯丙烷代谢途径中的关键酶,在豆类萌发过程中,苯丙烷类代谢增强[24],有报道认为钙离子可显著促进苯丙氨酸解氨酶解氨酶活性,该酶是苯丙烷类代谢途径中的关键酶和限速酶,其活性的大小与多酚、生物碱等重要刺激代谢产物的积累有极其密切的关系,导致黄酮和酚类物质的积累[25-26]。本实验中总酚、总黄酮和抗坏血酸含量表现出相似的趋势,在发芽4 d内随发芽时间延长而增加,并且2 mmol/L氯化钙处理下表现出更高的总酚和总黄酮含量,这与赵艳等[27]和喻最新等[28]的研究结果一致,本实验中总花青素与DPPH自由基清除能力和亚铁还原能力间的相关性不显著(P>0.05),这可能与花青素极易降解的特性有关[2]。由此表明总黄酮、总酚和抗坏血酸在绿豆芽菜的抗氧化中起主要作用,而不是总花青素,这与魏美霞等[29]和刘婷婷等[2]将豆类的主要抗氧化作用归因于总酚和黄酮类物质的研究结果相似。

发芽是一项有效改善豆类感官品质和营养品质的加工工艺。本实验研究了氯化钙处理对绿豆芽菜基础营养物质及其抗氧化活性的影响,结果表明,0.5 mmol/L和2.0 mmol/L的钙浓度处理均可显著提高绿豆芽菜中游离氨基酸、总糖、可溶性糖含量。2 mmol/L氯化钙处理下表现出更高的总酚和总黄酮含量。此外,除总花青素外,总酚、总黄酮和抗坏血酸含量均随着发芽时间的延长而有不同程度的增加。相关性结果表明,抗氧化能力主要与酚类物质和抗坏血酸含量有关,因此综合研究结果考虑,建议喷施2.0 mmol/L的钙浓度对绿豆芽菜各方面的影响效果最优,同时发芽时间选取4 d,此时绿豆芽中含有较高的抗氧化物质和较高的抗氧化能力,对人体最有益。