核桃肽的制备、分离纯化及生物活性研究进展

李溢真 ，陈 勉 ，袁丹丹 ，牛林林 ，袁嘉丽，陈 磊 ， 马学彬 ，王传金 ，孔令斌 ，尉 茜 ，刘 飞 *

（1. 山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室 山东省多糖类药物工程实验室 多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室 博士后科研工作站，山东 济南 250101；2. 山东省生物医药科学院有限公司，山东济南 250101；3. 云南中医药大学 云南省中医药分子生物学重点实验室，云南 昆明 650500）

核桃（Juglansmandshurica）原产于东亚、北美和欧洲东南部，在我国种植广泛[1]。核桃富含不饱和脂肪酸、蛋白质、多酚和矿物质[2]，具有抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、抗炎[5]、降低胆固醇[6]、降低血压和心血管疾病风险的作用[7]。核桃仁的脂质含量高达74 %，可加工成核桃油，但下脚料核桃粕却未被合理利用。据报道，核桃粕中约45 %为蛋白质，含有18种氨基酸，其中8种必需氨基酸的含量能满足人体需要[8]。生物活性多肽由2～20个氨基酸通过肽键连接而成，主要由动物或植物的食物蛋白，通过酶解、发酵或体内体外消化获得[9]。近年，有研究利用不同技术由核桃粕（蛋白质）制备并分离纯化具有抗氧化、抗高血压、免疫活性和神经活性的核桃肽。核桃肽作为一种新型核桃粕深加工产品，具有广阔的应用前景和市场潜力。

1 核桃肽的制备

从植物中制备活性多肽的方法有酶法、发酵法和化学法等。化学法通过酸或碱催化水解蛋白质，产生活性肽。反应过程较难控制，环境友好性低，不适合产业化。目前，制备核桃肽主要采用酶法和发酵法。

1.1 酶法制备

常用的核桃蛋白水解酶有胃蛋白酶[10]、胰蛋白酶[11]、碱性蛋白酶[12]、木瓜蛋白酶[13]、中性蛋白酶[14]、复合蛋白酶（胰酶）[15]等。酶具有特异性、高效性、专一性等特点，酶的种类、pH、温度、酶解时间、酶活性、料液比和酶底物比等条件对于酶法制备核桃肽至关重要。

利用碱性蛋白酶酶解核桃肽，酶解工艺不同，制备的效果也不同。弘子姗等[16]通过四因素三水平正交试验，加酶量为300 U/ml、pH 10、酶解温度50 ℃、酶解3.5 h，多肽得率为80.34 %。张研彦等[17]酶解工艺条件为温度50 ℃、pH 9、加酶量3.0 %、酶解时间5.0 h，水解度达22.63 %，多肽得率为88.24 %。张庆[18]等通过Box-Behnken中心组合试验表明，酶解最佳工艺条件为酶解温度50.24 ℃、加酶量2.03 %、pH 7.13、酶解时间4.2 h，得到多肽质量浓度为2.55 mg/ml。马开创[19]利用酶水解结合碱溶酸沉法，酶解温度50.0 ℃、pH 9、加酶量3.0 %、酶解时间5.0 h；在此条件下，水解度为22.63 %，多肽得率为88.24 %。木瓜蛋白酶、胃蛋白酶也常用来制备核桃肽。王攀等[13]研究表明，当木瓜蛋白酶酶解温度为60 ℃、酶解时间为3.5 h、底物浓度为2.5 g/100 ml、加酶量为6500 U/g、pH为6.5时，酶解物的抗氧化活性较好。侯雅坤[20]研究表明，木瓜蛋白酶酶解温度50 ℃、料液比1:25、pH 6.0、加酶量3 %、酶解时间4 h，最终得水解度15.63 %酶解液；胃蛋白酶酶解温度55 ℃、料液比1:20、pH 3.0、加酶量4 %、酶解时间4 h，最终得水解度15.72 %酶解液。

1.2 发酵法制备

通过发酵生产生物活性肽，不仅降低生产成本，还能在发酵过程中对蛋白质原料起到解毒去苦作用。目前发酵方法有两种：固体发酵和液体发酵。

刘潇等[21]对比枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis10160）和黑曲霉（GIM3.452）固态发酵制备核桃粕多肽的生产性能，筛选最优发酵条件参数，相对分子质量（Mr）分布测定结果表明，枯草芽孢杆菌固态发酵制备核桃粕多肽产量高于黑曲霉。许典等[22]将核桃粕烘干脱脂制成核桃粕粉末后，用黑曲霉液态发酵制备核桃肽液，过滤去杂质，冷冻干燥制得核桃肽粉。高瑞雄等[23]用纳豆芽孢杆菌（Bacillussubtilsnatto）进行液态发酵，发酵时间84 h、底物质量浓度0.08 g/ml、起始pH 8.0、接种量11 %、发酵温度33 ℃时，核桃肽质量浓度2.58 mg/ml，水解度37.5 %，均达最大值。贺莹等[24]用乳酸菌液态发酵，进行三因素三水平的响应面综合分析，得最优工艺参数：超声功率156 W、发酵温度42.3 ℃、发酵时间9.9 h；在此条件下，核桃肽质量浓度为2.88 mg/ml。王瑞珍[25]利用纳豆芽孢杆菌分别与戴尔凯氏有孢圆酵母（Torlaspora delbrueckii）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）混合固态发酵核桃粕，发酵60 h后，多肽含量分别达到了2.49 %和4.03 %。

2 核桃肽的分离纯化

通过酶法或发酵法制得的核桃蛋白水解物由不同Mr的活性肽、大分子蛋白、固体杂质和可溶性杂质组成。在研究和生产中，通过对目标产物进行分离纯化获得活性成分含量更高、纯度更高的核桃肽。膜分离技术（超滤法）和色谱技术广泛用于核桃肽的分离和纯化。

2.1 超滤法

核桃肽分离纯化的第一步通常是超滤。 核桃蛋白水解液在压力驱动下通过一定孔径的超滤膜，核桃肽因其粒径较小而能顺利通过超滤膜，而Mr较大的不溶物、酶和蛋白质则留在膜外，从而达到初步纯化的目的[26]。 初步纯化的核桃肽可依次通过不同孔径的超滤膜，完成不同范围Mr多肽的分离[27]。 然而，用超滤技术很难有效分离Mr很小或相似的多肽。 因此，在实际研究中，常与色谱技术相结合。

2.2 色谱法

核桃肽分离纯化的第二步为色谱法，较常用的色谱方法有凝胶渗透色谱 （GPC）、离子交换色谱 （IEC）、高效液相色谱 （HPLC）、反相高效液相色谱法 （RP-HPLC）和金属亲和色谱法（MAC）[28]。

上述方法各有优缺点， 单一的技术无法完全、高效的分离纯化核桃肽。 因此，在实际操作过程中，需综合考虑核桃肽的多种性质，采用多种方法组合技术对其进行分离纯化，以达到更好的分离纯化效果 。

3 核桃肽的生物活性

3.1 抗氧化活性

人体内氧化产生的自由基与人体衰老和多种疾病有关[29]。丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）等化学合成的抗氧化剂因其毒副作用，不利于人体健康[30]。李敏等[31]用超声辅助提取核桃蛋白，用中性蛋白酶酶解核桃蛋白后制备的核桃肽提取液，对超氧阴离子自由基的清除率达58.27 %，对羟基自由基的清除率达71.92 %，对DPPH自由基的清除率达68.93 %，抗氧化效果显著。王鲁黔[32]利用碱性蛋白酶制备的核桃肽，其DPPH和ABTS自由基清除能力与维生素C相当，具有较强的自由基清除能力。安传相等[33]研究核桃肽清除·OH和DPPH自由基的IC50值分别为15.43和18.38 mg/ml，具有良好的抗氧化能力。慈傲特[34]制备的的核桃肽经超滤分级，Mr＜3000的多肽有较好的体外抗氧化活性和体内抗氧化活性，可提高小鼠血清、肝脏和脾脏中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活性，降低氧化产物丙二醛（MDA）的含量。该多肽进一步分离纯化后得到抗氧化肽LAYLQYTDFETR，其浓度为0.1 mg/ml时，DPPH自由基清除能力、·OH清除能力和ABTS自由基清除能力分别为56.25 %，47.42 %和67.67 %。

3.2 降血压活性

血管紧张素转换酶（ACE）是一种二肽基羧肽酶，在肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统中起作用，导致血压升高。ACE抑制肽可抑制ACE的活性，降低血管的张力、血容量和血压，对调节人体血压起重要作用。从食物蛋白中提取的ACE抑制肽可有效降低高血压，但对正常血压无影响，与降压药相比没有副作用[36]。核桃粕酶解液中Mr小于10000的核桃肽对ACE抑制率较高，各组分IC50值表明，碱性蛋白酶酶解液和胃蛋白酶酶解液中Mr小于5000组分对ACE 抑制效果较突出[20]。以Alcalase酶酶解得到的核桃肽，色谱纯化后ACE抑制率最高可达90.35 %，IC50值为0.158 mg/ml；通过液质联用（UPLC-MALDITOF/MS）鉴定出两种ACE抑制肽：Leu-Tyr（LY）和Tyr-Leu-Ala（YLA），其化学合成肽IC50值分别为42和396 μmol/L，均有较强的ACE抑制效果[12]。利用胃蛋白酶酶解核桃粕，并分离制备抑制肽粗品，高效液相色谱筛选活性较高的ACE抑制肽粗品，其IC50达0.2633 mg/ml[37]。经测序后，人工合成ACE抑制肽YVPHWNL，利用体外模拟胃肠消化实验检测其活性，得到消化前后ACE抑制肽的IC50值分别是0.1357和0.1732 μmol/ml。贾靖霖[38]通用碱溶酸沉法提取蛋白质，当酶解液的浓度达到0.081 g/10 g时，对ACE的抑制作用最强，表明核桃蛋白酶解物有降血压活性。周慧江[39]用Alcalase 2.4L制备核桃蛋白酶解物，ACE抑制率为76.58 %，成分研究表明，疏水性氨基酸含量较高，对ACE抑制率有重要作用；超滤分离得到MWCO组分为Mr1000透过液组分，ACE抑制活性最高达78.43 % ，IC50为2.055 mg/ml；对MWCO进行脱盐纯化，ACE抑制率为80.73 %，IC50为1.65 mg/ml，降血压活性显著增强。

3.3 抗高尿酸活性

高尿酸血症与高血压、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗和肾脏疾病密切相关，其发病率越来越高，严重影响人类生活质量[40]。通常用于治疗高尿酸血症的药物有一定副作用。近年，一些食物源性具有优异黄嘌呤氧化酶抑制剂（XOI）活性的生物活性肽被广泛关注。核桃粕水解物和脱酚核桃粕水解物（DWMH）均具有较好的XOI活性[41]，可有效降低高尿酸血症大鼠的血清尿酸水平。从 DWMH 中成功分离纯化出两种新型抗高尿酸肽 WEPKDEX 和ADIYTE，Mr分别为 640.8和 710.7，IC50值分别为17.75和 19.01 mg/ml。Li 等[42]进一步研究核桃活性肽在体外的XOI活性和作用机制，发现含色氨酸的活性肽能有效抑制黄嘌呤氧化酶，且随色氨酸量增加，含色氨酸多肽的XOI活性也显著增强。与别嘌呤醇类似，色氨酸与黄嘌呤氧化酶的关键残基如Glu802、Leu873等有正向相互作用，从而有效抑制黄嘌呤氧化酶的活性。苏国万等[43]公开了一种从核桃粕中制备具有降尿酸作用的生物活性肽的方法，此法制得的靶标生物活性肽可显着降低大鼠血清肌酐水平，对大鼠肾功能有一定的保护作用，有显著的降尿酸作用。

3.4 健脑益智活性

脑外伤、应激创伤、精神发育迟滞、柯萨可夫综合征、阿尔茨海默病和一氧化碳中毒等疾病，可诱发学习和记忆功能障碍。现阶段改善该障碍的药物如多奈哌齐、盐酸美金刚等均有明显的副作用。核桃自古便有健脑益智作用的记载，近年大量研究表明，核桃肽能提高学习与记忆功能，有优越的健脑益智活性。

Morris水迷宫实验结果表明[44]，核桃肽YVLLPSPK通过减轻氧化应激缓解认知缺陷。透射电镜观察小鼠海马组织线粒体形态并进行Western blot和免疫荧光分析，结果表明，YVLLPSPK通过NRF2/KEAP1/HO-1通路与PINK1介导的线粒体自噬相关，改善了东莨菪碱所致认知功能障碍小鼠的学习记忆能力。核桃肽显著提高学习记忆损伤小鼠模型血清中抗氧化酶（SOD 和 GSH-Px）含量，抑制脑组织中一氧化氮合酶（NOS）生成，显著降低氧化产物（MDA 和 NO）含量，有效改善了小鼠对空间和有害刺激的学习记忆能力[45]。其中PW5 肽的抗 Aβ蛋白聚集活性最佳，具有预防阿尔茨海默病的潜质。核桃肽MWHP（Mr＜3000）对记忆障碍的抑制作用研究表明[46]，小鼠行为学实验Morris水迷宫测试中，MWHP缩短东莨菪碱诱导小鼠到达终点时间，减少错误次数，增加到达终点的动物数量。 MWHP 还延长了被动回避响应测试中的潜伏期，并减少错误率。结果表明，MWHP（Mr＜3000）可抑制东莨菪碱引起的记忆障碍；在机制研究中，MWHP（Mr＜3000）通过减少氧化应激、抑制细胞凋亡、调节神经递质功能、维持海马CA3 锥体神经元和增加脑组织中钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II 水平，改善记忆。核桃肽对过氧化氢（H2O2）与β淀粉样多肽蛋白（Aβ25-35）诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞的损伤有良好的保护作用，其神经保护作用的机制与提高PC12细胞的抗氧化能力有关；Morris水迷宫及电跳台实验证实了核桃肽显著改善Aβ25-35小鼠的认知障碍和长期记忆的能力，具有健脑益智活性[47]。

4 结论与展望

核桃油作为优质功能油其年消费量逐年增加，其副产品核桃粕的产量也在逐年增加。核桃粕是一种优质的植物蛋白资源，却被视为废物或低价值饲料、肥料等材料。核桃粕的经济利用不足在一定程度上阻碍了核桃产业的发展。有效利用核桃粕蛋白开发核桃蛋白产品，对于实现核桃综合利用、提高副产品附加值、改变利用率低的现状具有重要意义。