硫酸化透明质酸的制备、活性及应用研究进展

卞兆荃，魏 健，王成山，郭学平

（华熙生物科技股份有限公司，山东 济南 250101）

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖双糖重复单元组成的糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）。HA广泛分布于机体各组织中，具有特殊的理化性质和独特的生理功能，广泛用于骨科[1]、眼科[2]、化妆品[3]和保健食品[4]等多个领域。但未经改性的HA有稳定性差、易降解等缺点，在人体中无法长期保留，限制了其在药物和组织支架等方面的应用。通过对HA进行改性得到HA衍生物可有效克服这些缺点，拓展其应用[5-7]。

硫酸化透明质酸（sulphated hyaluronic acid或sulfated hyaluronic acid，sHA）是HA的硫酸酯。近年研究表明，相比其他硫酸化多糖，sHA表现出更优异的抗炎和抗肿瘤等功效，在伤口愈合和生物涂层方面，sHA同样显示出广阔的应用前景。本文对sHA的制备、生物活性以及现有和潜在应用研究进展进行综述。

1 sHA的合成

sHA的合成方法较多，早期EP0940410A1[8]采用HA四丁基铵盐与三氧化硫-吡啶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中低温反应，后期加入冰水终止反应，经沉淀、透析、冷冻干燥后可得sHA。Hintze等[9]用三氧化硫-DMF作为反应物，该反应物相比三氧化硫-吡啶更适于合成高取代sHA，室温反应1 h即可得到取代度2.8以上的sHA，现已成为较主流的合成sHA方法。Guarise等[10]用甲烷磺酸作为助溶剂实现了HA钠盐在DMF中的溶解，再与三氧化硫-吡啶复合物反应得到sHA。与传统方法相比，此法可省去前期合成HA四丁基铵盐的步骤。Fidia公司进一步优化纯化工艺[11]，后处理采用一系列精细的洗涤步骤代替传统的透析操作，得到了纯度和产率均极高的sHA产品，可有效减少后处理时间和成本。

2 sHA的生物活性

2.1 抗肿瘤、癌症

已有研究指出，HA可调节、抑制癌细胞生长和转移[12-13]，对HA进行修饰可进一步加强其抗肿瘤和抗癌活性。近年，sHA等HA衍生物在抗肿瘤、抗癌方面的研究受到广泛关注。Benitez等[14]研究sHA在前列腺癌细胞中的作用，结果表明，sHA可有效减弱透明质酸酶HYAL1的活性，抑制癌细胞的增殖和侵袭。Jordan等[15]发现，在膀胱癌的临床前模型中，sHA可能通过抑制血管生成和HA受体-PI-3K/AKT信号，从而抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭，表现抗肿瘤活性。Koutsakis等[16]用Mr50×103的HA和sHA处理乳腺癌细胞，在抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力方面，sHA效果更显著；进一步研究表明，sHA抗癌活性可能与其更强地促进上皮间质转化标记物表达、抑制基质金属蛋白酶表达有关。Spinelli等[17]评估不同取代度sHA（0.7，sHA1；2.5，sHA3）对乳腺癌、肺癌和结直肠癌模型肿瘤细胞的作用及对肿瘤微环境中的其他细胞（如单核/巨噬细胞）的作用，结果表明，在肿瘤细胞中sHA3能降低细胞活性并诱导细胞毒性，sHA3未引起细胞凋亡但显著降低细胞增殖率，即sHA3通过诱导细胞凋亡以外的分子死亡机制影响癌细胞的死亡；进一步研究表明，sHA降低单核/巨噬细胞中血管生成因子和结合蛋白（如肿瘤坏死因子α诱导蛋白6）表达，下调HA水平，进而诱导形成抗肿瘤和抗血管生成微环境。

2.2 抗凝血

肝素是常见的临床用天然抗凝剂，但过高的抗凝血作用会诱发不良反应。Magnani等[18]合成了7种不同取代度sHA并进行抗凝血实验研究，结果表明，sHA的抗凝血作用随取代度增加而提高，但与天然肝素相比，其显示更弱的全身抗凝活性。抗凝血酶III（AT-III）与肝素结合被活化，进而与凝血酶相互作用并抑制血液凝固。Miura等[19]分别向血浆中添加肝素和sHA，通过测量残余凝血酶量评估AT-III的活性，结果表明，与肝素不同，sHA不能促进人血浆中AT-III与凝血酶的结合，故表现出更弱的抗凝血作用。

2.3 抗炎

Savage等[20]研究高取代度sHA对牙周炎的抑制作用发现高取代度sHA抑制与牙周炎的发生密切相关的多个因素，如牙龈杆菌生长和生物膜形成、Toll样受体2/ Toll样受体4介导的细胞激活和体外破骨细胞的形成等。这种对牙周炎多种介质的联合作用有助于预防或治疗牙周炎。Jouy等[21]研究表明，高取代sHA对体外培养的人巨噬细胞有很强的抗炎作用，即使被降解至低分子量依然能保持活性，弥补了作为抗炎药的高分子量HA用于炎症环境时可能被降解致使无效或促炎的缺陷。Pulsipher等[22]研究sHA对口腔黏膜炎的影响，sHA可靶向模式识别受体并抑制下游促炎细胞因子表达，有效干预辐射诱导的小鼠的口腔黏膜炎，且可在不干扰辐射治疗的情况下诱导肿瘤消退，有望成为一种潜在治疗药物。

2.4 对细胞因子和酶的作用

2.4.1 转化生长因子β1（TGF-β1） 转化生长因子β（TGF-β）是一组调节细胞迁移、黏附、增殖和分化[23-25]的细胞因子。其中，TGF-β1活性最强，在调节炎症反应、免疫反应，广泛参与体内各种生理、病理过程中起作用。Smissen等[26]研究表明，含有sHA的人工细胞外基质可显著降低TGF-β1的生物活性。另外，sHA通过占用结合位点阻止TGF-β1的信号通路，从而减少TGF-β1驱动的真皮成纤维细胞分化。Koehler等[27]通过表面等离子体共振检测TGF-β1受体复合物与sHA的相互作用，发现高取代sHA阻断了TGF-β1与转化生长因子β1型受体（TβR-I）和转化生长因子βII型受体（TβR-II）的结合。进一步研究表明，sHA更倾向结合TGF-β1上的TβR-I位点，形成的复合物又会阻碍配体与TβR-II位点的结合。然而向TβR-II/TGF-β1复合物中添加高取代sHA可显著提升与TβR-I的结合，表明结合顺序非常重要。因sHA衍生物对TGF-β1生物活性的抑制作用可能有助于局部干预TGF-β1驱动的皮肤纤维化，故其是很有前景的功能性生物材料。

2.4.2 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） 人诱导多能干细胞（hiPSCs）保持未分化状态，具有多能性，有望应用于药物开发[28]、发育研究[29]、免疫调节[30]和再生医学[31]等诸多领域。bFGF是维持hiPSC未分化状态的重要信号因子。已有研究表明，在人星形胶质细胞和人表皮角质形成细胞的培养过程中加入sHA，可促进bFGF信号传导[32]。机制研究表明[33]，sHA对bFGF有很高的结合亲和力，二者结合后可增强bFGF/细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号传导，并在无养料和无bFGF条件下维持hiPSC的未分化状态和多能性。同时，HA不会与bFGF结合或促进bFGF/ERK信号转导，也不能维持hiPSC的未分化状态。这为避免人为添加bFGF所带来的高成本及可能的异种污染提供了解决方案。

2.4.3 血管内皮生长因子165（VEGF165） 血管内皮生长因子A（VEGF-A）是一种同二聚体糖蛋白，是生理和病理血管生成中最有效和特异的调节剂。VEGF165是VEGF-A的主要亚型，在细胞外基质中与硫酸化糖胺聚糖（sGAG）相互作用并在血管生成、血管内皮细胞存活中发挥作用。Koehler等[34]通过实验和计算研究证实，sGAG干扰VEGF165与血管内皮生长因子受体-2的相互作用，抑制了VEGF165的生物活性，从而发挥抗血管生成的作用。这一发现为sGAG衍生物在血管生成过程中的调节潜力提供了新的见解，并为sGAG在治疗异常血管生成方面的应用前景指明了方向。

2.4.4 基质金属蛋白酶（MMP）与组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP） 细胞外基质是一个高度动态的网络，通过微调蛋白质的形成和降解平衡不断重塑。MMP是细胞外基质降解的关键协调者，活性受TIMP和GAG控制。在慢性创伤中，MMP和TIMP之间的不平衡会导致病理性的细胞外基质降解，需要新的适应性生物材料与这些调节因子相互作用重建平衡。Rother等[35]研究表明，sHA以一种明确的方式隔离TIMP-3，而不改变其对基质金属蛋白酶1（MMP-1）和基质金属蛋白酶2（MMP-2）的抑制电位，因此有望通过sHA调节TIMP-3水平，从而控制细胞外基质的重塑。Ruiz-Gómez等[36]研究MMP-2与不同GAG（硫酸软骨素、HA、sHA和肝素）的相互作用，以及GAG对MMP-2/TIMP-3复合物形成的影响发现，sHA降低MMP-2和TIMP-3蛋白水平及MMP-2活性，且只有sHA支持这两种蛋白在纤维状结构中的排列。模型结果表明，sHA通过抑制它们的相互作用，影响TIMP-3诱导的MMP-2抑制。

2.4.5 透明质酸酶 探索能特异性阻断透明质酸酶的抑制剂有利于相应疾病治疗的发展。Isoyama等[37]评估21种抗透明质酸酶1（HYAL-1）、睾丸、蜂毒和链霉菌透明质酸酶抑制剂发现，sHA能最有效地抑制 HYAL-1，但也能降低蜂毒透明质酸酶和睾丸透明质酸酶的活性。细胞迁移诱导透明质酸酶1（CEMIP）是最近发现的一种透明质酸酶，通过不同于其他透明质酸酶的机制和条件切割HA。Schmaus等[38]研究表明，高取代sHA可有效抑制CEMIP活性，且其抑制CEMIP的选择性高于其他透明质酸酶。此外，高取代sHA对HA水平的影响是通过CEMIP抑制介导，表明sHA衍生物抑制CEMIP在依赖于CEMIP功能的病理条件下具有潜在效用。

3 应用

3.1 伤口敷料

Rother等[39]将胶原蛋白和高取代sHA组成的人工细胞外基质加入HA/胶原基水凝胶中，所得改良水凝胶可结合大量TGF-β1，并延缓凝胶中生长因子释放，通过重新平衡失调的TGF-β1诱导的细胞反应来改善皮肤修复。Thönes等[40]研究表明，含有sHA的凝胶可在较长时间内结合并缓慢释放肝素结合表皮生长因子，从而诱导角质形成细胞迁移和表皮生长因子受体信号传导等，进而促进伤口愈合。除此之外，含sHA的水凝胶被证实可用于调节炎症巨噬细胞活性和缓释VEGF165，以改善皮肤创面愈合结果，故在伤口愈合材料方面表现出应用潜力[41-42]。

3.2 组织支架、涂层

Guarise等[43]合成了一种多巴胺功能化sHA负载抗生素，将所得材料用于涂覆钛假体。带负电荷的sHA既能高效地与带正电荷的抗生素进行静电结合加以固定，又能起到骨再生作用。通过从植入物涂层持续释放抗生素，抑制细菌传播；后续体外实验进一步验证了该涂层的抗菌性[44]。Al-Maawi等[45]将高取代sHA与胶原纤维结合获得功能化胶原基支架。细胞实验表明，该支架可减少细胞因子VEGF、TGF-β1释放，增加白细胞介素8和上皮生长因子释放，并在30 d后可充分融入植入区并保持稳定的结构，有望成为一种全层皮肤再生支架。Krieghoff等[46]将含有sHA的人工细胞外基质包覆在支架上，研究评估所得支架的成骨潜力。结果表明，加入高取代sHA可提升小鼠和人间充质干细胞的成骨能力和矿化能力，表明涂层对成骨有积极作用。Kemkemer等[47]研制了一种含水的高分子量sHA涂层，用于改善热塑性聚碳酸酯聚氨酯弹性体（TPCU）的表面性能；该功能化不仅提高材料生物相容性，也可增加TPCU的耐磨性；体外实验表明，使用该涂层后的TPCU支架表面的软骨细胞增殖明显增强。

3.3 治疗性药物、材料

Kabra等[48]研究表明，sHA既能抑制胶原介导的血小板结合，又能抑制血小板衍生生长因子活性，故可作为一种潜在的肝纤维化治疗药物。Dickkopf-1（Dkk1）是一种与骨愈合相关的Wnt抑制因子，Gronbach等[49]证实sHA对Dkk1具有有效清除作用，结合sHA的生物大分子材料有望应用于未来成骨和骨缺损愈合相关的临床。Nguyen等[50]将不同取代度sHA和胺基封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）偶联获得了一种治疗性热凝胶，用于治疗角膜炎症，该治疗剂对眼表面具有热响应性，能输送sHA至少7 d，因此在角膜区域可有效发挥抗炎和延长治疗活性的效果。

3.4 药物输送

Purcell等[51]开发了硫酸化和甲基丙烯酸酯改性的HA大分子单体，并通过自由基引发的交联将它们整合到HA水凝胶中。研究表明，sHA大分子单体与肝素结合蛋白（SDF-1α）具有与肝素相当的亲和力，故该功能化水凝胶可有效减缓包裹的SDF-1α释放，用于各种药物输送应用。CN110200911A[52]公布了一种sHA-阿霉素（DOX）聚合物和sHA-甘草次酸聚合物自组装组成混合纳米胶束，实现了肝癌靶向给药和DOX在肿瘤细胞内的有效释放，从而实现更强的肿瘤抑制作用。

4 展望

随着对sHA研究的进行和报告，功效及其基本功效机制已有了大体的认知，但其背后更深一层的原理及机制如对细胞因子的调节方面，还需更多研究以丰富其理论，才能更好地指引未来应用。同时，sHA的应用研究多局限于实验室或动物模型阶段，临床转化尚需更多研究提供信息与数据以进一步验证其功效。

总之，sHA是一种极具前景的HA衍生物，随着未来研究及临床的逐渐深入，相信sHA的功效机制会被不断揭晓，相应应用也会被不断挖掘和扩充，在各研究领域必将不断诞生出更多成熟产品。