聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)负载汉防己甲素纳米微球治疗干眼的效果评价△

李 涛 张 玉 朱胜兰 唐 娟 刘兴德 吴小利 方其林 李 盈 漆 星 林 胜 戴传强 周 燕

干眼是一种由多因素引起的疾病,常伴泪膜渗透压增高、泪膜稳定性下降及眼表炎症[1-2]。患者常出现眼部干涩感、畏光、眼红,甚至视物模糊等表现。

目前世界范围内的干眼发病率为5.5%～33.7%,其中女性高于男性,我国干眼的发病率为21%,但基于我国的卫生条件和健康状态,其发病率在某些地区可能更高[3-4]。目前针对干眼的主要治疗策略包括局部泪液替代物、抗炎、促分泌、泪小点堵塞、自体血清、治疗性角膜接触镜以及眼睑闭合等处理。其中,人工泪液替代物因其无明显的不良反应已经成为目前主要且最常用的具有润滑角膜和减少泪液蒸发作用的治疗方式[5-6]。研究显示,干眼的治疗除需增加人工泪液的使用外,抗炎治疗在该病的发病和发展中也具有非常重要的作用,如何控制角膜上皮细胞诱发的炎症反应,减少由丝裂原活化蛋白激酶途径及k基因结合核因途径产生的相关炎症细胞和炎症因子的表达,减少持续性损伤角结膜上皮细胞和结膜杯状细胞,从而提高黏蛋白的表达,提升泪膜的稳定性十分重要[7-9]。然而,传统的皮质类固醇抗炎药物易导致高眼压和白内障等并发症,因此,探索一种对于干眼治疗具有抗炎作用且对眼部不良反应少的药物不可或缺[10-11]。

汉防己甲素(Tet)是一种从中药汉防己中提取出的双苄基异喹啉生物碱。研究显示,Tet具有抗氧化和抑制炎症反应等作用[12-13];也有关于其对干眼、青光眼、角膜雾状混浊、结膜炎及葡萄膜炎等眼部疾病治疗的相关报道[14-18]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)由2种单体,即乳酸和羟基乙酸随机聚合而成,是一种可降解的功能高分子有机化合物,具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能,被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。在眼科领域,PLGA近年来得到了广泛的研究。因此,本研究旨在通过PLGA负载Tet,利用PLGA的药物缓释特性,延长Tet的抗炎疗效,进一步探讨Tet治疗干眼的效果。

1 材料与方法

1.1 纳米球的制备

采用薄膜分散-水化超声法制备Tet和PLGA的纳米微球[Tet-人工泪液(ATS)@PLGA]颗粒,ATS为玻璃酸钠滴眼液,通过透射电镜观察合成药物的纳米结构,马尔文粒径仪测量Tet-ATS@PLGA的粒径和Zeta电位,并在4℃的PBS分散液中保存,分别于第1、2、3、4、5、6、7天测量其粒径变化,评估其稳定性。配置不同浓度的Tet甲醇溶液,通过紫外分光光度计测量其吸收度,根据最大吸光度值确定吸收峰,并且计算各自的浓度-吸光度标准曲线。Tet包封率=载药量/总投入量×100%;Tet载药率=载药量/PLGA总量×100%。

1.2 方法

1.2.1 干眼动物模型建立

选用新西兰大白兔(从重庆医科大学动物研究中心购买并饲养),体重2.0～2.5 kg,兔子左眼局部给予体积分数0.1%苯扎氯氨40 μL滴眼,每天3次,给药7 d建立干眼动物模型。当实验动物角膜荧光染色达到4分标准时,表示干眼动物模型建立成功。具体检测方法:在结膜囊中滴入10 g·L-1荧光素钠2 μL,在裂隙灯下观察角膜染色的范围和程度,采用标准化评分法分析染色结果。其中,0分:角膜不着色;1分:角膜微度损伤,仅限于浅表上皮的点状染色,散在点状染色包括微凹染色范围≤15%;2分:角膜轻度损伤,局部或散在点状染色范围16%～30%,可波及深层上皮,缓慢轻度基质着色,明亮;3分:角膜中度损伤,最大直径超过2 mm的密集团块状染色,大点融合状,范围31%～45%,波及深层上皮,快速局限性基质着色,明亮;4分:角膜重度损伤,直径超过2 mm的密集团块状染色,片状,范围>45%,波及深层上皮,快速弥漫性基质着色,明亮。

1.2.2 实验分组

将未进行任何干预的正常兔眼设为正常组(5只);将干眼模型兔随机分为控制组、ATS组、Tet-ATS组、Tet-ATS@PLGA组,每组5只,其中控制组未予以处理,ATS组、Tet-ATS组、Tet-ATS@PLGA组分别局部予以30 μL的 ATS、Tet-ATS和Tet-ATS@PLGA悬液滴眼,每天3次。Tet-ATS组和Tet-ATS@PLGA组使用的Tet浓度相同(0.1 g·L-1)。干预14 d之后进行组间检测数据比较。

1.2.3 观察指标

测量并比较各组的眼压;流式细胞术检测药物作用于炎症化兔角膜上皮细胞24 h后各组的细胞存活率(细胞层面实验Tet浓度为5 mg·L-1);对角膜组织用荧光素钠进行染色,裂隙灯下观察角膜上皮着染情况并评分、记录泪膜破裂时间(BUT);Schirmer试纸检测兔眼表泪液量分泌情况;HE染色后观察各组角膜上皮厚度、球结膜杯状细胞形态和数量;提取兔角膜蛋白行ELISA实验检测血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素(IL)-1β、前列腺素E2(PGE2)和肿瘤坏死因子(TNF)-α炎症因子表达情况。

1.3 统计学处理

应用SPSS 20.0统计软件处理数据,计数资料采用平均数±标准差表示,采用独立样本t检验进行组间比较。检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 Tet-ATS@PLGA物理化学特性

相同浓度下,体积分数0.1%的Tet溶解于ATS后呈透明色,而附着于PLGA后呈乳白色。通过透射电镜观察,Tet-ATS@PLGA呈表面粗糙的球形结构,Tet附着于球的表面(图1)。

单PLGA及Tet-ATS@PLGA的粒径分布图见图2。单PLGA 颗粒和Tet-ATS@PLGA颗粒的平均粒径分别为(105.12±8.79)nm和(115.62±10.37)nm,其动态光分散指数分别为0.132和0.161(均<0.250)。进一步通过马尔粒径仪检测Tet-ATS@PLGA室温(25 ℃)下第1、3、5、7天的平均粒径变化,结果显示Tet-ATS@PLGA在PBS中高度稳定(图3)。

通过Tet的紫外吸收光谱标准曲线,采用线性回归方程Y=12 582.34X-680.23(R2=0.999 21)(图4)计算出Tet-ATS@PLGA药物的包封率和载药量分别为77.43%和30.26%。同时马尔文粒径仪测得单PLGA颗粒和Tet-ATS@PLGA颗粒的Zeta平均电位分别为(-34.27±1.08)mV和(21.34±0.69)mV,表明通过药物修饰后,单PLGA颗粒表面带正电荷,在这种情况下,具有脂溶性药物特性的Tet可以更多地黏附到单PLGA颗粒上,从而使Tet-ATS@PLGA更好地适应负电荷的眼表环境。

根据高效液相色谱分析仪对Tet的标定曲线计算其累积释出量,结果显示,在4 ℃(储存温度)、25 ℃(室温)和33 ℃(眼表温度)条件下,经过600 min累计释放率分别为(4.45±0.34)%、(5.37±0.42)% 和(72.54±2.68)%,在眼表温度下,Tet很容易从Tet-ATS@PLGA中释放出来,而在储存温度和室温下则很难释放(图5)。

图1 Tet-ATS@PLGA颗粒透射电镜图

A:单PLGA颗粒;B:Tet-ATS@PLGA颗粒。图2 单PLGA及Tet-ATS@PLGA的粒径分布图(PLGA浓度:100 mg·L-1)

图3 Tet-ATS@PLGA室温状态(25 ℃)下第1、3、5、7天的平均粒径和动态光分散指数变化

2.2 临床治疗效果评价

正常组BUT为(16.47±0.87)s,控制组BUT降至最低,为(5.54±0.39)s,ATS组[(7.94±0.67)s]、Tet-ATS组[(9.67±0.71) s]、Tet-ATS@PLGA组[(11.97±0.86)s]BUT逐渐增加,其中Tet-ATS@PLGA组BUT最大,其与正常组、控制组及Tet-ATS组BUT比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图6A)。与正常组泪液分泌量[(17.45±0.83)mm]相比,控制组[(5.78±0.47)mm]泪液分泌量最低,ATS组[(7.34±0.67)mm]、Tet-ATS组[(9.35±0.58)mm]、Tet-ATS@PLGA组[(14.78±0.82)mm]泪液分泌量逐渐增加,其中Tet-ATS@PLGA组泪液分泌量最大,其与正常组、控制组及Tet-ATS组泪液分泌量比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图6B)。与控制组[(14.67±0.73)mmHg](1 kPa=7.5 mmHg)眼压相比,ATS组[(14.84±0.69)mmHg]眼压无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),Tet-ATS组[(12.56±0.67)mmHg]及Tet-ATS@PLGA组[(10.42±0.37)mmHg]眼压明显降低,其中Tet-ATS@PLGA组眼压降低最底,其与正常组、控制组及Tet-ATS组眼压比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图6C)。

图4 Tet的紫外吸收光谱标准曲线。图5 不同温度(4、25、33 ℃)下ATS溶液中Tet-ATS@PLGA的Tet体外累积释放率

A:4组BUT比较;B:4组泪液分泌量比较;C:4组眼压比较。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.000 1;ns:差异无统计学意义。图6 正常组、ATS组、Tet-ATS组及 Tet-ATS@PLGA组干预14 d后的BUT、泪液分泌量及眼压比较

2.3 角膜病理切片治疗效果评价

经过14 d干预后,与正常组角膜上皮厚度[(60.45±3.67)mm]相比,控制组角膜上皮厚度恢复过程缓慢[(21.48±2.89)mm],ATS组[(34.38±3.89)mm]、Tet-ATS组[(48.47±3.12)mm]及Tet-ATS@PLGA组[(57.78±3.35)mm]角膜上皮厚度逐渐增加,其中Tet-ATS@PLGA组角膜上皮厚度恢复接近正常(图7)。角膜上皮荧光染色显示,无论是干预7 d还是14 d,控制组、ATS 组、Tet-ATS组及Tet-ATS@PLGA组角膜染色显示不同的恢复进展,Tet-ATS@PLGA组在任何检测时间点与控制组、ATS组和Tet-ATS组相比,染色面积和染色强度均显著降低(图8)。干预14 d后,正常组、控制组、ATS组、Tet-ATS组、Tet-ATS组及Tet-ATS@PLGA组眼球结膜细胞印迹中阳性细胞数(过碘酸雪夫染色)分别为(2 410.37±347.82)个、(457.12±78.34)个、(804.34±94.06)个、(1 785.26±47.86)个及(2 206.54±245.7)个,Tet-ATS@PLGA组球结膜杯状细胞数量恢复最多,接近正常组数量(图9);并且在控制组中,炎症化的球结膜杯状细胞细胞体积和细胞核均明显增大,而予以干预后,Tet-ATS@PLGA组细胞体积逐渐恢复正常。

A:4组角膜上皮厚度HE染色图。B:4组角膜上皮厚度比较;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001;ns:差异无统计学意义。图7 正常组、ATS组、Tet-ATS组及 Tet-ATS@PLGA组干预14 d后的角膜石蜡切片HE染色图及角膜上皮厚度比较

*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;ns:差异无统计学意义。图8 ATS组、Tet-ATS组及Tet-ATS@PLGA组干预 7 d 及14 d后的角膜荧光染色评分比较。图9 正常组、控制组、ATS组、Tet-ATS组和Tet-ATS@PLGA组干预14 d后球结膜杯状细胞数量比较

2.4 细胞层面抗炎效果评价

与控制组24 h炎症化兔角膜上皮细胞凋亡率[(16.45±1.07)%]比较,ATS组[(17.24±0.95)%]、Tet-ATS组[(39.64±1.37)%]和Tet-ATS@PLGA组[(52.48±1.43)%]24 h炎症化兔角膜上皮细胞凋亡率逐渐升高,其中Tet-ATS@PLGA组炎症化兔角膜上皮细胞凋亡率最高(图10)。

2.5 动物层面抗炎效果评价

ELISA实验检测结果显示,与正常组VEGF、IL-1β、PGE2和TNF-α炎症因子表达水平相比,控制组和ATS组中上述炎症因子表达明显增加,控制组与ATS组上述炎症因子比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05),Tet-ATS 组及Tet-ATS@PLGA组VEGF、IL-1β、TNF-α和PGE2表达水平逐渐降低,其中Tet-ATS@PLGA组炎症因子表达下调最明显,其与正常组、控制组及Tet-ATS组上述炎症因子比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图11)。

A:4组流式细胞术检测炎症化细胞凋亡率图。B:4组炎症化细胞凋亡率比较;**P<0.01;***P<0.001;ns:差异无统计学意义。图10 控制组、ATS组、Tet-ATS组及Tet-ATS@PLGA组炎症化兔角膜上皮细胞24 h后细胞凋亡率比较(Tet浓度:5 mg·L-1)

A:4组VEGF表达水平比较;B:4组IL-1β表达水平比较;C:4组PGE2表达水平比较;D:4组TNF-α表达水平比较。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;ns:差异无统计学意义。图11 控制组、ATS组、Tet-ATS组及Tet-ATS@PLGA组干预14 d后角膜内VEGF、IL-1β,PGE2及TNF-α蛋白表达水平比较

3 讨论

如何控制干眼患者眼表的炎症反应,对于控制疾病的发生与发展具有重要作用,特别是VEGF、IL-1β、TNF-α和PGE2等炎症因子的表达对于评估疾病的控制与转归具有指导作用[19-20]。传统的皮质类固醇抗炎药物,如氟米龙滴眼液、妥布霉素地塞米松滴眼液等药物若使用不当,易导致高眼压和白内障等疾病,从而限制了其临床使用。研究显示,Tet可有效抑制VEGF、IL-1β、TNF-α和PGE2的释放,从而达到治疗葡萄膜炎和结膜炎等炎症疾病的目的[15-16]。因此,本研究假设Tet可有效抑制干眼形成过程中相关炎症因子的表达,进一步利用PLGA作为纳米药物载体,利用纳米材料易修饰性、缓释性、靶向性和良好的生物相容性等优势,研制一种旨在阻断干眼形成通路且不良反应较小的新药。

本研究中,Tet-ATS@PLGA的物理化学特性,如粒径、形态、电位以及紫外光谱结果均表明Tet成功负载于PLGA;同时通过7 d的Tet-ATS@PLGA粒径变化观察证明了其具有良好的稳定性,并且可在 4 ℃ 和25 ℃下稳定存在,在33 ℃时具有良好的释放性;此外,Tet的包封率和载药量进一步表明该新型纳米药物的成功合成。本研究中,与正常组相比,兔角膜经过干眼建模后,泪液的质和/或量明显发生变化,控制组BUT和泪液分泌量均明显降低,经ATS、Tet-ATS、Tet-ATS@PLGA干预后数据均有所回升,其中Tet-ATS@PLGA组数据回升最多,但仍然少于正常兔眼的泪液分泌量,表明干预14 d后,虽然干眼模型兔泪腺并未完全恢复,但均有所改善,其中Tet-ATS@PLGA组眼表泪液分泌改善最明显。干预前后眼压变化结果显示,ATS组与控制组间眼压变化无统计学意义,但Tet-ATS组与Tet-ATS@PLGA组间眼压差异有统计学意义,且Tet-ATS@PLGA组眼压降低最多,提示Tet长期使用不仅不会升高患者眼压,甚至还有一定的降眼压作用。

角膜上皮HE染色病理切片分析结果显示,干预14 d后,Tet-ATS@PLGA组兔杯状细胞数量最多、角膜上皮最厚,角膜上皮凋亡细胞最少。流式细胞术检测炎症化兔角膜上皮细胞凋亡结果表明,与控制组相比,ATS组细胞凋亡率无明显变化,而Tet-ATS组和Tet-ATS@PLGA组细胞凋亡率逐渐增加,表明Tet可有效促进干眼细胞模型炎症化兔角膜上皮细胞凋亡,阻止细胞炎症化表达。与此同时,提取各组角膜组织进行ELISA实验,检测各组角膜组织中炎症因子的表达水平,结果显示,ATS组、Tet-ATS组及Tet-ATS@PLGA组VEGF、IL-1β、TNF-α及PGE2的表达均下调,上述炎症因子的表达水平:ATS组>Tet-ATS组>Tet-ATS@PLGA组。这表明,ATS虽然具有纤维连接蛋白相结合的功效,可以发挥促进角膜上皮生长、促进角膜创伤治愈以及保水的药理作用,但与Tet相比,Tet可以有效控制干眼角膜内炎症反应,包括细胞迁移、增殖、黏附、分化以及伴随发生的细胞分层,促进角膜上皮的修复,其中NF-кB信号通路在促进角膜上皮更新和修复过程中发挥了重要作用[21-22]。

4 结论

本研究采用传统的薄膜分散-超声乳化法成功合成了一种新型纳米药物,即Tet-ATS@PLGA,该纳米药物可有效作用于炎症化兔角膜上皮细胞,促进炎症细胞凋亡,并进一步通过抑制VEGF、IL-1β、TNF-α和PGE2的表达控制兔干眼模型的炎症反应,改善眼表泪液分泌情况,为干眼的治疗提供了一种新的治疗策略。