珍稀濒危植物陕西羽叶报春的开花及传粉生物学研究

杨 柳,周天华,王 勇,牛 鑫

(陕西理工大学 生物科学与工程学院,陕西汉中 723000)

植物濒危的原因很多,其中有性生殖的传粉过程至关重要[1]。传粉生物学是研究与传粉事件有关的种种生物学特性及其规律的一门学科,传粉是种子植物受精的必经阶段[2],是保护生物学的主要内容。国内学者以濒危植物保护为目的开展了大量的传粉生物学研究工作,例如,对南川升麻(Cimicifugananchuanensis)[1]、秦岭岩白菜(B.scopulosa)[3]、丰都车前(P.fengdouensis)[4]等珍稀濒危植物进行了传粉生物学研究,探讨了其致濒限制因子。目前,国内外还未对陕西羽叶报春的传粉生物学进行研究报道,仅对它的人工栽培[5]、种子萌发[6]、叶绿体全基因组[7]等方面进行了研究报道,但对报春花属其他种的开花及传粉进行了研究报道。 例如,钱长江等[8]以习水报春(P.lithophila)为研究对象,对其传粉昆虫及其访花行为进行了研究,表明其访花昆虫有22种,为习水报春的育种和资源保护提供参考。邵剑文等[9]对安徽羽叶报春(P.merrilliana)的有效传粉昆虫、传粉行为及花朵密度和种群大小对传粉效果的影响进行了研究,证明花朵密度和种群大小与访花行为呈正相关关系。还对翠南报春(P.sieboldii)[10]、滇海水仙花(P.pseudodenticulata)[11]、巨伞钟报春(P.florindae)[12]等的开花及传粉特性进行了研究报道。

二型花柱(distyly)是一种最常见的雌雄蕊异位类型,其产生和维持机制一直是进化生物学和生态学的研究热点,迄今为止,至少发现有23科植物存在二型花柱[13]。二型花柱是指同一物种具有长柱花(即雌蕊位于花冠筒口,雄蕊位于花筒中部)和短柱花(即雄蕊位于花冠筒口,雌蕊位于花筒中部)两种类型的花朵,二型花具有严格的自交不亲和特性[14-15]。二型花柱现象是在粉报春和耳报春中被首次发现的[16],报春花属91%的物种都为二型花柱植物,历来是研究二型花柱的模式植物。例如,邵剑文等[17]对安徽羽叶报春(P.merrilliana)两种花型的开花与传粉特性进行了比较研究,结果表明长、短柱花的花冠大小、花粉柱头活力无明显差异,异型花授粉的结籽率明显高于自花授粉和同型异花授粉结籽率。李娟等[18]研究了四季报春(P.obconica)二型花的开花物候和繁育特性,表明长、短柱花存在差异,自交不亲和,但型类有一定亲和性。还对海仙花报春(P.poissonii)[19]、钟花报春(P.sikkimensis)[20]、雪地报春(P.nivalis)[21]、中甸灯台报春(P.chungensis)[22]、偏花报春(P.secundiflora)[23]等的二型花柱进行了研究报道。

陕西羽叶报春(PrimulafilchneraeKnuth)是报春花科(Primulaceae)、报春花属(PrimulaL.)典型的二型花柱植物,为中国现存的珍稀濒危植物之一,是陕西省地方重点保护植物,中国植物志和《中国物种红色名录》曾均认为它已在野外灭绝[24]。截止目前,该物种的野生分布仅见于陕西省洋县、勉县和湖北省竹山。其野外分布十分狭窄,生境破碎,个体数量稀少,在未来极大概率会再次灭绝。因此,为揭示陕西羽叶报春的濒危机制及传粉机制、繁育系统等生殖特性,本文就陕西羽叶报春的开花及传粉生物学特性进行研究,为陕西羽叶报春的物种保护提供科学依据。

1 研究地概况

在2021年3-5月以及2022年3月对陕西羽叶报春进行野外观察。观察地点设置在陕西省汉中市勉县元墩镇唐湾村(106°32′59.28″E,33°0′19.74″N)和杨庄村(106°34′17.69″E,33°0′38.49″N)2个居群,两居群距离约2 km,生于海拔600～800 m的湿润且多砂石的阴坡上。观察点周边植被丰富,伴生植物有碎米荠(Cardaminehirsuta)、广布野豌豆(Viciacracca)、虎耳草(Saxifragastolonifera)、蒲儿根(Sinoseneciooldhamianus)、蒲公英(Taraxacummongolicum)等。

2 研究方法

2.1 开花物候及花部形态特征观测

在陕西羽叶报春初花期记录第一朵花的开放时间,于末花期记录最后一朵花闭合时间。随机选定20朵处于花蕾期的陕西羽叶报春,进行标号,观察其开放状态及花的颜色变化并记录其花朵开放及凋谢时间。随机选取研究地盛开的陕西羽叶报春长、短柱型花20朵,用电子游标卡尺对花的花冠口直径、花冠筒长度、雄蕊高度、雌蕊高度进行测量。

2.2 传粉媒介的行为观察及种类鉴定

采用定位观察法,于陕西羽叶报春盛花期,随机对已开放花序进行连续观察3～4 d。从7:00-18:00 连续观察,统计每1 h内前30 min时程内访花昆虫的种类及数量,记录访花昆虫的访问次数、停留时间、同一访问者一次访问花的数目(同株)、株数。并对每种昆虫的访花行为进行摄影,必要时可采集标本以备种类鉴定时用。记录天气变化对访花者的影响。

2.3 花粉活力与柱头可授性

对种群不同发育阶段的花,采用MTT法[25-26]检测花粉活力与柱头可授性。具有活力的花粉或具有可授性的柱头会被染成深蓝色或深紫色,颜色由浅变深,柱头可授性也由弱变强;若没有活力或可授性,则没有颜色变化。花粉活力=被染色花粉数/测量花粉总数×100%。

2.4 花粉胚珠比(P/O)的测定

随机剪取长、短柱型花冠未打开的陕西羽叶报春花朵各20朵,放入固定液(70%酒精)中保存;取出花朵并用镊子将全部花药取下放入离心管,用蒸馏水定容到0.5 mL,用镊子将花药碾碎使花粉全部散出,然后用移液枪吸取一定的花粉粒悬浮液滴到载玻片上,在显微镜下计数花粉粒数;用生物解剖针在解剖镜下将子房小心剖开,统计其胚珠数。每朵花的花粉数量与其对应花的胚珠数量的比值,得到单花的花粉胚珠比。同样的方法重复40朵花,花粉胚珠比各取其平均值。依据Cruden[27]标准对所得的P/O值来判定其的繁育系统。

2.5 杂交指数(OCI)的估算

根据Dafni[28]的标准,以花序直径、开花行为对繁育系统进行评判。三者之和为杂交指数OCI值。(1)花冠直径<1 mm记为0;1～2 mm记为1;2～6 mm记为2;>6 mm记为3。(2)花药开裂时间与柱头具可授性时间一致或雌蕊先熟记为0;雄蕊先熟记为1。(3)柱头与花药的空间位置:同一高度记为0;空间分离记为1。

2.6 繁育系统检测

为检测陕西羽叶报春的繁育系统,于盛花期,在样地随机选取未开放朵花(尽可能选在不同花序上),并根据Dafni的方法[28],设立以下6个处理:①自然对照,不去雄,不套袋,自由授粉;②自然自花授粉,开花前套袋,不去雄;③自然异花授粉,去雄,不套袋,自由授粉;④人工同株异花授粉,去雄,套袋,同株异花之间传粉;⑤人工异株异花授粉,去雄,套袋,异株异花之间传粉;⑥检测有无融合生殖,去雄,套袋,不授粉。硫酸纸袋套袋用,并挂牌标记,7 d后去袋,观察记录结实情况。结实率=结实数/处理花朵数×100%。

3 结果与分析

3.1 开花物候及单花花期动态

通过野外观察,其种群花期为2-4月中旬,初花期在2月中旬,盛花期在3月初到3月末,末花期在4月中旬,5月初种子成熟脱落。其花期长达2个月左右。通过对20朵花单花花期的观测得出:单花花期一般为14～17 d。单花开花过程中花部形态有6个明显发育变化:全部被萼片包裹(图1,A)、花苞伸出并为深粉色(图1,B)、花朵打开为淡粉色(图1,C)、花冠为白色(图1,D)、花朵枯萎(图1,E)、花冠脱落花萼宿存(图1,F)。从花冠伸出到花朵枯萎可观察到花冠颜色是由深至浅的一个变化过程,但蜜导颜色变化却是由浅至深。花朵完全打开一般需2 d时间,并且在一天中的任何时候都可开放。

A. 被萼片包裹;B. 花苞伸出为深粉色;C. 花朵打开为淡粉色;D. 花冠为白色;E. 花朵枯萎;F. 花冠脱落花萼宿存。图1 陕西羽叶报春不同生长阶段的花部形态变化A. All wrapped by sepals; B. The buds extended and showed dark pink; C. The flowers opened and showed pale pink; D. The corolla was white; E. The flowers withered; F. The corolla fell off and calyx persistent.Fig.1 Morphological changes of flowers in different growth stages of P. filchnerae

3.2 花部形态特征

陕西羽叶报春花葶一至多枚自叶丛中抽出(图2,A);花序为伞形花序,3～15朵花,一般是1～2轮,有时出现第3轮花序;开花后锥状花萼逐渐膨大呈灯笼状,花凋谢后花萼宿存(图2,B);花冠高脚蝶形,紫色或粉红色,花瓣5,基部蜜导颜色多彩(图2,C),花朵略有香气;花筒底部分泌有微量花蜜;雄蕊5,柱头分为长柱型和短柱型;蒴果成熟后为黑色或深褐色,细小呈球形(图2,D、E)。

图2 ‘彼得’花粉离体萌发Fig. 2 Pollen germination of N. ‘Peter Slocum’ in vitro

A. 整株形态;B. 花萼形态及花谢后宿存;C. 蜜导;D、E. 种子形态特征;F. 短柱型花;G. 长柱型花;H. 短柱型花解剖图;I. 长柱型花解剖图。图2 陕西羽叶报春的花部特征A. The whole plant morphology; B. Calyx morphology and persistent after anthesis; C. The honey guide; D and E. Morphological characteristics of seeds; F. Short-styled morph; G. Long-styled morph; H. The anatomical drawing of short-styled morph; I. The anatomical drawing of long-styled morph.Fig.2 The floral characteristics of P. filchnerae

陕西羽叶报春具花柱二型现象。花瓣打开后,短柱型花可见花药位于花冠口或略低,发现3 d后花药开裂并散粉,柱头位于花筒中部不易见(图2,F,H);长柱型花可见柱头位于花冠口或略高,花药位于花筒中部不易见(图2,G,I);花谢时,雌蕊随花冠一块脱落,雄蕊保留或干枯后掉落。此外,长柱型花雌蕊高是短柱型花雌蕊的1.76倍,长柱型花冠直径较短柱型花冠略长,花筒高度较短柱型花筒低。

3.3 访花昆虫的种类、访花频率及访花行为

自然状态下,连续数天野外观察陕西羽叶报春的访花昆虫,发现其访花昆虫为蜂类(图3),主要有大蜜蜂(ApisdorsataFabr.)和中华蜜蜂(ApisceranaFabr.),其他昆虫几乎未见。大蜜蜂访花时会先在花冠上空停留1～2 s,然后落在花冠上,长喙伸入花筒内吸取花蜜,后足收集花粉,形成一个花粉块,身体会触碰到柱头,访花2～4 s,然后访问下一朵花;中华蜜蜂会直接落到花冠上,伸出长喙至蜜腺吸食花蜜,用足刮取花粉并会触碰到柱头,访花1～2 s,访花时间较短。访花时观察发现,访花者一般对才开放或花瓣颜色较深的花访花时间较长,对花瓣颜色转白的花(花粉几乎散完)访花时间很短或直接不访花。晴天时,在上午9:00之前访花者很少,在11:00-16:00,访花昆虫较多,在14:00最多。阴天时访花者很少或几乎没有(图4)。

A.大蜜蜂;B.中华蜜蜂图3 陕西羽叶报春的访花昆虫A. Apis dorsata Fabr.; B. A. cerana Fabr.Fig.3 Insect visitors of P. filchnerae

图4 陕西羽叶报春不同天气情况下访花者的日活动数量Fig.4 Number of daily activities of flower visitors under different weather conditions of P. filchnerae

3.4 花粉活力及柱头可授性

采用MTT法检测陕西羽叶报春不同时期的花粉活力和柱头可授性,如表1所示:其柱头在花药未开裂前就具有可授性,在开花后第2天柱头可授性达到最高,持续到第8天后可授性开始减弱,直到花枯萎后依然有部分柱头具有可授性。花药未开裂前花粉已具有较高活力,为74.62%,花药在开花后第3天开裂并散粉,在第4天花粉活力达到最高,为98.18%,此后花粉活力逐渐下降,第10天花粉活力不到20%,此后几乎没有活力。

表1 供试睡莲的性状特征

表1 陕西羽叶报春花粉活力及柱头可授性

3.5 花粉胚珠比

随机抽取研究样地长、短柱型花各20朵花进行花粉胚珠计数,实验得出:长、短柱型每朵花平均花粉量分别为33 564粒和29 809粒,平均胚珠数分别为37粒和36粒,花粉胚珠比分别为902.26和831.48。根据Cruden标准得出,陕西羽叶报春的繁育系统为兼性异交类型。

3.6 杂交指数

陕西羽叶报春长、短柱型的花冠直径分别为21.57 mm和21.48 mm,均大于6 mm,记为3;花药5个,柱头在花药开裂前就具有可授性,记为0;长、短柱型花均是柱头与花药空间分离,记为1;得出杂交指数OCI为4。根据Dafni的标准,其繁育系统为异交型,部分自交亲和,多数需要传粉者。

3.7 繁育系统

通过自然和人工授粉实验,长、短柱型花套袋实验结果如表2。结果表明,陕西羽叶报春在去雄套袋不授粉处理下,结实率为0,可排除无融合生殖的可能性;在自然条件下能够结实,长、短柱型花结实率分别为85%和80%,部分存在胚胎败育情况;在套袋不去雄、同株异花传粉、去雄不套袋处理下,结实率为0或很低;在异株异花授粉处理下,长柱花型结实率为90%,短柱花型结实率为95%。陕西羽叶报春异型交配可育,同型交配是不可育的,这一结果支持Darwin[29]的观点。由此表明,陕西羽叶报春为异交型,自交不亲和,需要传粉者。

表2 18种或品种睡莲属植物花粉形态特征(a)

表2 不同处理条件下陕西羽叶报春长、短花柱的结实率

4 讨论与结论

4.1 陕西羽叶报春的繁育系统

植物的繁育系统是与植物的繁育紧密联系在一起的,是植物繁育的核心内容之一[30],对其深入研究对濒危和稀有物种的保护和管理具有重要意义[31]。本试验结果得出:陕西羽叶报春的繁育系统类型为异交型,自交不亲和,需要传粉者,为虫媒传粉类型。雌雄异熟、异位被认为是植物避免花内自交、提高异交率的机制[32-33]。陕西羽叶报春具有稳定的花柱二型结构,柱头和花药的空间分离避免了雌、雄功能间的干扰,并降低了自交程度。从不同发育阶段的花粉活力及柱头可授性检测结果来看,其具有雌雄异熟特征,表现为雌蕊先熟。柱头在花粉未开裂前就具有可授性,从而提高了异交机会。长柱型花的花冠直径、花粉胚珠比都比短柱型花大;在套袋实验中,与同属安徽羽叶报春、四季报春型内表现为一定的自交亲和性相比,陕西羽叶报春长、短柱型花都表现出严格的自交不亲和性,其异型交配(即长柱型花的花粉授给短柱型花的柱头或短柱型花的花粉授给长柱型花的柱头)的可育性较高,而同型交配(即长柱型花的花粉授给长柱型花的柱头或短柱型花的花粉授给短柱型花的柱头)不可育,因此可判断陕西羽叶报春不仅是形态意义上而且是功能意义上的典型花柱二型植物,这确保了种间杂交的优势。

4.2 开花物候与植物传粉生殖的关系

开花物候是植物生殖生态研究的一个重要内容[34]。植物个体或种群的开花物候可以用一系列参数如开花数、开花时间和开花持续时间等来量化,这些参数能显著影响植物的生殖成功[35]。对陕西羽叶报春开花物候的观察表明,其单花花期一般为14～17 d,种群花期为2—4月中旬。开花时间较长,且表现出明显的开花不同步性,这不仅保证了植株在较长时间内能成功完成传粉受精过程而保证其生殖成功,而且也可降低花期恶劣的自然环境如倒春寒对其生殖成功造成的不良影响。这就是陕西羽叶报春长期适应环境影响所形成的一种生殖策略。正如焦培培等[36]对濒危植物矮沙冬青开花物候的研究也支持了这一观点。Godin等也认为单花花期会在不利环境条件下延长以延长昆虫授粉时间[37]。

4.3 花部形态对传粉者的影响

植物花的特征可从两个层次认识,即花部构成和花的开放式样[38]。这二者对植物在开花过程中吸引传粉者有很大影响,从而影响其花粉散播及传粉效率,作为回报传粉昆虫会获得相应的食物营养[39]。从陕西羽叶报春的花部特征来看,整体花部结构虽然相对较小,但其花瓣颜色艳丽,蜜导颜色多彩,能有效吸引昆虫前来传粉。本研究观察到花冠颜色变化是由深至浅的一个过程,但蜜导颜色变化却是由浅至深,花瓣打开前期颜色较深可吸引昆虫前来传粉,当后期花瓣颜色变淡后就通过颜色加深的蜜导来吸引传粉。花蜜和花粉可能在近距离对访花者有诱导作用,花朵略有香气,对访花者的诱导作用也较小。其开花时间较长,花粉活力及柱头可授性保持时间长,故能有效提高花粉散播及传粉效率。长、短柱型花这一花部特征也增大了异花传粉的机率,表现出对异花传粉的适应。另外,访花者还受天气情况影响。不同类型的访花者对光的敏感程度不同,虫媒花通常有紫外光的反射光谱,能被许多昆虫视觉感知[40]。野外观察发现,晴天时,一天中清晨和下午18:00以后温度较低时访花者较少或没有,中午阳光较强、温度较高时访花者较多;在阴天,一天中访花者很少或没有。说明陕西羽叶报春的访花者在温度上升或有阳光时,更能被引诱进行传粉,提高了传粉者活动。

4.4 陕西羽叶报春致濒因素探讨

陕西羽叶报春为典型的早春开花植物,目前观察仅为虫媒传粉类型,因此昆虫的传粉活动对其异型受精显得尤为重要。本研究观察到,其传粉者仅为蜂类,传粉者种类很少,并且传粉行为受阴雨天和低温影响,会导致传粉效率大幅下降。彭东辉等[41]也指出种植地区多阴雨、大风等天气,势必将影响昆虫的访花行为,可大大降低花朵授粉的机会,从而导致传粉失败。昆虫在转运花粉时也会造成大量花粉损失[42-43],其不可靠性会导致异交率的下降。另外,也有学者认为传粉者之间的竞争对繁殖系统有着重要的影响[44-46]。野外调查发现陕西羽叶报春的种群规模大都偏小和碎片化,部分种群密度过低,就会引起传粉者之间的竞争,出现花粉限制;部分种群密度过高时,传粉者种类少,就很难保证每朵花都授粉成功;传粉效果差,导致部分胚珠败育,从而影响生长繁育和结实。

Piper等指出,当受到环境胁迫时,自花授粉可以代替异花授粉而确保受精成功[47]。Holsinger提出当由于很低的种群密度或缺少传粉者等导致外来花粉量不足时,自交可以提高植物结实率,即产生繁育保障效应[48]。陕西羽叶报春作为典型的花柱异型植物,其繁育系统为异交型,具有严格的自交不亲和性,需要异型花柱花传粉,说明其受到环境胁迫时,自交是不能代替异花授粉而确保受精成功,从而导致胚珠败育,这也是导致其濒危的原因之一。

遗传多样性是种群的重要特性之一。由于环境在随时变化,种群也要保持丰富的多样性才能适应这些变化,多样性低的种群容易发生近交而降低个体和种群的适合度[49]。本研究地分布范围狭窄,两种群地理距离较近,相距约2 km,这就导致了种群间的基因交流频繁,从而降低了遗传多样性。研究发现两种群规模偏小且碎片化,说明该种群遗传漂变严重,种群越小,遗传漂变就越严重,这可能改变某一等位基因的频率,甚至致其完全消失,进而降低种群遗传多样性。由于遗传漂变的作用致使自然种群中的遗传变异迅速降低甚至丧失,最后可能致使种群灭绝。

图版Ⅲ 睡莲花粉不同纹饰特征A. 瘤状(白睡莲);B.微波纹起伏状(巨花睡莲);C.小颗粒状(‘彼得’);D.小柱状(‘征服者’);E.网纹状(印度红);F.长条状(‘火冠’)PlateⅢ Different patterns of Nymphaea pollensA. Nodular (N. alba); B. Corrugated undulation pattern (N. gigantea); C. Small granular (N. ‘Peter Slocum’);D. Small cylindrical (N. ‘Conqueror’); E. Checkered shape (N. rubra); F. Long strip (N. ‘Firecrest’)

图版Ⅱ 不同种或品种睡莲花粉形态(b)A. 香睡莲;B.‘宽瓣白睡莲’;C.‘达尔文’;D.‘火冠’;E.白睡莲;F.‘亚克’;G.‘佛罗里达’;H.‘征服者’PlateⅡ Pollen morphology of different species or cultivars of Nymphaea (b)A. N. odorata var. alba; B. N. ‘Alba Plenssima’; C. N. ‘Darwin’; D. N. ‘Firecrest’; E. N. alba; F. N. ‘Arc-En-Ciel’; G. N. ‘Florida Sunset’; H. N. ‘Conqueror’

图版Ⅰ 不同种或品种睡莲花粉形态(a)A.埃及白睡莲;B.喀麦隆睡莲;C.印度红睡莲;D.埃及蓝睡莲;E.蓝星睡莲;F.小花睡莲;G.巨花睡莲;H.‘彼得’;I.睡莲子午莲;J.墨西哥黄睡莲PlateⅠ Pollen morphology of different species or cultivars of Nymphaea (a)A. N. caerulea; B. N. zenkeri; C. N. rubra; D. N. caerulea; E. N. colorata; F. N. micrantha; G. N. gigantea; H. N. ‘Peter Slocum’; I. N. tetragona; J. N. mexicana