贵州西北喀斯特区古茶树叶片解剖结构及抗旱性评价

仇 杰,高 超,罗洪发

(1 贵州大学贵州省森林资源与环境研究中心/贵州省高原山地林木培育重点实验室/林学院,贵阳 550025;2 贵州大学 农学院,贵阳 550025)

古茶树是指分布于天然林中的野生古茶树及其群落,以及半驯化人工栽培的野生茶树和人工栽培百年以上古茶园(林)中的茶树[1]。作为茶树起源地之一,贵州境内20多个县(市)均有古茶树分布,历史悠久,资源丰富[2]。贵州省西北部毕节市七星关区有着“中国古茶树之乡”的称号,隶属于七星关区的亮岩镇拥有着全区大部分古茶树资源,可为茶树育种提供基础资料[3];其地理气候独特,土壤环境适宜,为古茶树持续发展提供了得天独厚的良好条件。茶树喜阴喜湿,适宜的水分条件和空气湿度为良好的茶叶品质提供保障。然而近年来随着全球气候变暖,大气温度有增无减。干旱是农业生产中的主要限制因子之一,植物在形态、生理、生化、细胞和分子水平上进化出一系列机制来克服水分亏缺或干旱胁迫[4]。干旱胁迫对茶叶产量的影响在世界上许多茶叶种植区都有报道,包括南非[5]、印度[6-7]、坦桑尼亚[8]等地。而贵州省近20年来有约70%的概率会发生高温、干旱的极端气候条件[9],这严重制约着茶树的生长,对茶叶品质产生了极大的影响,因此,关于其抗旱性的研究应予以充分重视。

植物的内外结构表现是在所处环境条件中长时间适应的结果,可将解剖结构特征作为研究植物抗旱性的1个主要评价指标。环境的变化容易导致叶片解剖结构发生变化以保证机体功能的正常运转[10],这种变化也将植物长期适应于生态条件的特点体现得淋漓尽致,在各种选择压迫下呈现出对不同逆境的响应类型。研究表明,叶片是可塑性较高的器官,长时间的缺水往往会导致叶片解剖结构指标发生变化以适应干旱胁迫所带来的伤害[11]。

近年来,随着研究的不断拓展和深入,关于抗旱性的研究已广泛涉及多个层面,包括生理生化特性、激素诱导、抗旱基因组等诸多方面[12-14]。而利用贵州古茶树叶片解剖结构指标来评价其抗旱性的研究少有报道,仅杨凤等[15]通过野生茶树扦插苗叶片解剖结构的4个指标来初步评价了其抗旱性。目前尚未见贵州省西北喀斯特区野生古茶树叶片解剖结构及其抗旱性的相关研究报道。野生古茶树品质特征和遗传多样性独特,是稀缺优质的良种选育资源。本研究拟利用贵州西北喀斯特区毕节市亮岩镇30个点古茶树的叶片解剖结构比较分析,明确贵州西北喀斯特区古茶树叶片解剖结构特征,并对其抗旱性进行综合评价,旨在筛选出亮岩镇抗旱性较强的古茶树,为高抗旱茶树品种选育、延续优质的古茶树资源以及发展茶产业提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 研究区概况

试验地位于贵州省西北地区毕节市七星关区亮岩镇,其海拔780～1 600 m,年均气温13.2 ℃,1月平均气温4.5 ℃,7月平均气温21.5 ℃,年降水量1 121.6 mm,年无霜期为280 d,茶树生长期较长。该地属典型的喀斯特溶岩山区[3]。

1.2 试验材料

在亮岩镇选择具有代表性的古茶树分布区,于2021年4月11日上午8:00-10:00进行采样,样点根据采样先后分别命名为bj-1,bj-2,…,bj-30,共计30个样点,详细信息见表1。每个样点按“S”形选择5株树,每株古茶树采集树冠向阳面第5～7节位、成熟且无病虫害叶片3片,共9片,将每个样点45片叶片混合均匀,随机选取3片作为试验材料。先以叶片主脉为中心剪切成5 mm×5 mm的叶片方块,再避开主脉剪切5 mm×5 mm的叶肉组织方块,随即放入卡诺液(V无水乙醇∶V冰醋酸=3∶1)中固定12 h,而后抽气并转入70%酒精中置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 试验方法

叶片解剖结构采用常规石蜡切片法来观测,将材料用酒精逐级脱水处理,再用酒精和二甲苯处理后在不同温度条件下使材料充分浸蜡后包埋[16]。用扫描电镜观察叶片气孔,石蜡切片机 (Leica RM2235) 切片,后经固绿染色等步骤,于显微镜(Leica DM2500)下观察拍照保存。将采集回来的新鲜叶片剪小粘放在样品台上后放置在离子溅射仪(MSP-mini)中喷金镀膜,在扫描电子显微镜(Hitachi TM4000 plus)200倍和2 000倍下观察拍照。利用Image J软件测量叶片厚度(LT)、上表皮厚度(TU)、下表皮厚度(TL)、栅栏组织厚度(TP)、海绵组织厚度(TS)、叶脉厚度(VT)、上角质层厚度(TUS)、下角质层厚度 (TLS)、气孔长(SL)、气孔宽(SW)。

依据以上测定结果计算栅海比(PS)、组织结构紧密度(CTR)、组织结构疏松度(SR)、叶脉突起度(VPD)、气孔密度(SD)。计算公式如下:

kPS=δTP/δTS

(1)

kCTR=δTP/δLT

(2)

kSR=δTS/δLT

(3)

kVPD=δVT/δLT

(4)

DSD=n/A

(5)

cv=σ/μ

(6)

式中:n为气孔个数;A为视野面积;cv为变异系数;σ为标准差;μ为平均值。

1.4 数据处理

利用Excel 2013统计并计算相关数据,用SPSS 20.0对数据进行描述性及方差分析、邓肯多重比较,利用Origin进行相关性分析和聚类分析,Photoshop 2019处理图片。

聚类分析后各类中典型指标的筛选依据相关指数的大小来进行选择,相关指数与代表性呈正相关[17]。其计算公式为:

(7)

采用隶属函数法综合评价30株古茶优良单株的抗旱性,计算公式为:

f(xi)=(Xi-Xi,min)/(Xi,max-Xi,min)

(8)

式中:f(xi) 为抗旱隶属函数值;Xi为某项指标的测定值;Xi,min和Xi,max分别为某一测定指标中的最小值和最大值。如果某一项指标与其对应优株抗旱性呈负相关,则利用反隶属函数进行转换,计算公式为:

f(xi)=1-(Xi-Xi,min)/(Xi,max-Xi,min)

(9)

根据式(7)～(9)计算各优良单株抗旱性解剖结构指标的平均隶属度,用平均隶属度来评价抗旱性,平均隶属度越大,抗旱性越强。

2 结果与分析

2.1 古茶树叶片解剖结构特征

通过对茶树叶片石蜡切片观察发现,其由上角质层、上表皮、栅栏组织、海绵组织、下表皮、下角质层、气孔(图1,A、B)以及叶脉(图1,C)组成。

上下表皮均由一层近似矩形的细胞排列而成,栅栏组织附着于上表皮下方,大多由2层不规则的长柱形细胞排列而成(图1,A),极少数叶片排列有3层栅栏组织(图1,B),细胞间排列紧凑。海绵组织相对栅栏组织排列较为疏松,由近似椭圆的细胞组成,大小不一,细胞间隙大。

叶片主脉由厚角组织、木质部、韧皮部、薄壁组织等组成(图1,C)。气孔由2个肾形保卫细胞包围(图1,D)。30个点茶树叶片、叶脉、气孔显微结构如图1,E-G所示。

2.2 古茶树叶片解剖结构指标的比较分析

叶片的解剖结构特征与植物的抗旱性密切相关。表2～4显示,亮岩古茶树叶片、叶脉、气孔等解剖结构特征参数在样点间均存在着显著差异。各指标参数的变异系数以栅栏组织厚度、栅海比、组织结构紧密度较大,分别为41.21%、35.45%和30.55%,以叶脉厚度、叶脉突起度和上表皮厚度较小,分别为7.31%、14.39%和16.23%,在样点间表现比较稳定。

2.2.1 叶片解剖结构叶片厚度通常可作为抗旱性研究的指标之一[18],所有供试材料中叶片厚度处于177.00(bj-5)～369.40(bj-13)μm之间,平均值为247.24 μm,变异系数为17.98%,表现相对稳定;叶片上表皮、下表皮厚度分别处于14.16(bj-26)～ 24.55 μm(bj-13)和13.26(bj-25)～21.97 μm(bi-19)之间,平均厚度分别为19.02 μm和17.74 μm,总体表现为下表皮略薄于上表皮;多层的栅栏组织是植物抗旱性强的表现之一,本研究中bj-13叶片栅栏组织为3层,厚度最大(187.86 μm),而整体平均厚度为89.29 μm,变异系数为41.21%,波动较大,稳定性较差。海绵组织厚度平均值为117.87 μm,在83.46(bj-8)～170.54 μm (bi-1)之间,变异系数为19.06%,表现较为稳定。

叶片上下表皮均覆盖有厚度不一的角质层,可减小叶表面除气孔外的水分散失[19],上、下角质层平均厚度分别为3.41 μm和2.58 μm。栅海比、组织结构紧密度和组织结构疏松度反映了栅栏组织、海绵组织与叶片厚度之间的关系,其平均值分别为0.76、0.35和0.48。栅海比的变异系数相对较大(35.45%),稳定性较差。

2.2.2 叶脉和气孔解剖结构叶脉平均厚度为808.62 μm,其变异系数在所有指标中最小(7.31%),表现稳定。叶脉突起度反映了叶脉与叶片间的相互关系,具有一定的遗传稳定性。

古茶树叶脉突起度平均值为3.35,在2.39(bj-13)～4.23(bj-24)范围内变化,变异系数为14.39%,表现相对稳定。气孔长、宽平均值分别为15.04 μm和6.38 μm,变异系数分别为15.04%和6.38%。气孔密度平均为141.32个/mm2,最小的是bj-2(87.43个/mm2),最大的是bj-14(260.86个/mm2),变异系数为23.66%。

2.3 古茶树抗旱性综合评价

2.3.1 古茶树抗旱性解剖结构指标筛选评价抗旱性的最优方案首先要筛选出彼此独立且具有代表性的指标[20]。据此,对亮岩镇30个点古茶树叶片解剖结构的15项指标进行聚类分析(图2),当阈值在0.8～0.9之间时,15项指标可划分为4类。第Ⅰ类指标包括叶片厚度、栅栏组织厚度、紧密度、栅海比、上表皮厚度、海绵组织厚度、叶脉厚度、上角质层厚度、气孔宽以及气孔密度;第Ⅱ类指标是下表皮厚度;第Ⅲ类指标为下角质层厚度;第Ⅳ类指标分别是气孔长、疏松度和叶脉突起度。

同时,对亮岩镇30个点古茶树叶片解剖结构的15项指标进行相关性分析,其结果表明各指标间存在一定程度的相关性(表5)。其中,叶片厚度与其他大部分指标间都存在显著的相关性;与组织结构疏松度和叶脉突起度为极显著负相关,相关系数分别为-0.43和-0.87;与除下角质层厚度和气孔长度外的其余指标均为显著正相关关系。叶片上表皮厚度与下表皮、栅栏组织、海绵组织和叶脉厚度之间均为极显著正相关,与叶脉突起度之间呈显著负相关。叶片下表皮厚度与海绵组织厚度和叶脉厚间呈极显著正相关关系。栅栏组织厚度与海绵组织厚度、叶脉厚度、栅海比以及组织结构紧密度间存在极显著正相关关系,与组织结构疏松度和叶脉突起度存在极显著负相关关系。海绵组织厚度与除气孔宽度、栅海比以及气孔密度外的其他指标间均存在显著相关关系。叶脉厚度与除气孔长和疏松度外的其他指标间均存在显著相关关系。上角质层厚度与气孔宽和紧密度存在极显著正相关关系,下角质层厚度与叶脉突起度间呈显著正相关关系。栅海比、紧密度、疏松度、叶脉突起度以及气孔密度与其他大部分指标间均有较强的正或负相关,而气孔长和气孔宽与其他大部分指标间相关关系不明显。

根据统计学相关知识、相关矩阵及聚类分析结果,按照公式(7)计算各类中各指标的相关指数,排序整理得到表6,典型指标为同类中相关指数最大的指标,如出现相关指数相同的情况,则再比较变异系数,选择变异系数较大的指标作为典型指标[21]。如表6所示,第Ⅰ类指标中栅栏组织厚度的相关指数最大(0.327),选择该指标为第Ⅰ类的典型指标;第Ⅱ类和第Ⅲ类指标由于都只有1个指标,故下表皮厚度和下角质层厚度为第Ⅱ类和第Ⅲ类的典型指标;第Ⅳ类中叶脉突起度相关指数(0.165)在同类中排序第一,选择它为第Ⅳ类的典型指标。综合以上分析,最终选择栅栏组织厚度、下表皮厚度、下角质层厚度以及叶脉突起度作为评价亮岩古茶树抗旱性的典型指标。

2.3.2 古茶树抗旱性综合评价根据筛选出的4个典型指标,依据公式(8)和公式(9),应用隶属函数法对亮岩镇30个点的古茶树进行抗旱性综合评价。根据平均隶属度大小排序,平均隶属度大,抗旱性强,平均隶属度小,抗旱性弱。结果(表7)表明:30个点的古茶树的抗旱性排序前5位依次为bj-15、bj-16、bj-29、bj-10和bj-24,抗旱性较强;抗旱性排序靠后的有bj-22、bj-20、bj-2、bj-11以及bj-6,抗旱性较弱;其他20个点的抗旱性居中。

表7 古茶树抗旱性综合性评价

3 讨 论

近年来,随着茶产业兴起,贵州各地需要大量优质的茶树资源,贵州西北喀斯特区野生古茶树作为茶树种质资源的一部分,研究其抗旱性有助于为茶园建设提供优良的育种材料、丰富贵州喀斯特区茶树种质资源库[22-23]。在非生物因素约束下,植物会发生一系列的形态、生理、生化和分子变化,并表现出各种不利症状,如褪绿、坏死、生长缓慢等,最终对植物的生长和产量产生不利影响[24]。在干旱胁迫条件下,植物光合作用、相对含水量、膜完整性、色素含量、渗透势、碳水化合物状态、抗氧化代谢、植物激素和调节基因都受到影响。叶片作为植物光合作用等生命代谢活动的重要器官,对于逆境胁迫的反应最为敏感[25-26],因此,叶片常常被作为主要研究对象。

关于叶片解剖结构与抗旱性间关系的研究已有诸多报道,前人研究认为抗旱性强的茶树品种叶片形态结构表现为角质层、栅栏组织和海绵组织厚度较大,其排列更加紧密,厚度越大,抗旱性越强[27-28]。在干旱胁迫下,越厚的角质层越有助于减少水分蒸发、增强边界阻力以保水及支撑叶片形态,上下表皮对于保护植物组织具有积极意义,它在复杂的外部环境与植物叶片组织间筑起一道屏障,可减轻高温带来的伤害[16,29]。本研究结果表明,30个点的古茶树抗旱性与其叶片下角质层厚度、气孔长等大小顺序较为一致,而与气孔密度等排列顺序有较大差异。说明用单个指标来评价古茶树抗旱性的结果误差较大,应结合多项指标综合评价。王烟霞等将叶片角质层厚度、叶片厚度、组织结构紧密度作为评价不同杨树(Populusspp.)抗旱性的主要指标;曾雯珺认为叶片厚度、气孔开度以及栅海比可以作为评价油茶(Camelliaoleifera)抗旱性的主要指标[30-31]。本研究通过对毕节市亮岩镇30个点古茶树叶片解剖结构的指标分析、相关性分析、聚类分析等,从15项指标中筛选出栅栏组织厚度、下表皮厚度、下角质层厚度以及叶脉突起度作为评价亮岩镇古茶树抗旱性的典型指标。将栅栏组织厚度作为典型指标与郭燕等对板栗(CastaneamollissimaBl.)的相关研究结果相同;将下表皮厚度作为典型指标与宋彬等的相关研究结果[32-33]相同。徐扬等将上角质层厚度列为4种苹果属抗旱性研究比较分析的典型指标之一,认为下角质层厚度与其他指标间差异不显著。张义等将上表皮厚度和叶脉厚度作为评价11种植物抗旱性的典型指标[34-35]。本研究将古茶树叶片下角质层厚度和叶脉突起度作为典型指标与前人研究结果不完全一致,植物抗逆性中典型指标的选择可能会因植物种类、生长环境、发育时期等的不同而不同[36]。笔者研究发现,亮岩镇古茶树叶片上下角质层厚度之间存在显著的正相关关系,而叶脉突起度是叶脉厚与叶片厚之间的比值,组成叶脉之一的木质部中含大量的木质素,木质素又是植物细胞壁的主要组成成分,保护植物细胞和组织免受不利影响。相关研究表明,木质素含量与植物抗逆性呈正相关[37-38]。因此,选择下角质层厚度和叶脉突起度这两个指标来评价亮岩镇古茶树抗旱性也可能具有积极意义。

隶属函数法是一种基于测定多项指标、可较为准确地对植物某一特性进行综合评价的方法,其操作更加方便快捷,其结果更为真实可靠。本研究利用隶属函数法从15项解剖结构指标筛选出4项指标来评价贵州省西北地区古茶树的抗旱性,筛选出的抗旱性表现较强的古茶树bj-15、bj-16、bj-29、bj-10、bj-24立地平均海拔1 357.04 m,而抗旱性表现较弱的古茶树bj-22、bj-20、bj-2、bj-11、bj-6立地平均海拔1 138.38 m。海拔梯度可以反映温湿度、光照、土壤等植物生长环境的诸多因子,因而可以作为研究植物适应性的重要参考指标[39]。前人研究发现,不同物种随海拔高度的升高,其叶片上下表皮及厚度会呈现不同的变化趋势[40-41]。本研究中古茶树叶片上下表皮及厚度对海拔的适应并不明显,而筛选出的抗旱性较强的5株茶树下角质层平均厚度排在供试材料前列,说明此区域古茶树下角质层厚度有随海拔升高而增加的趋势,进而增强古茶树对环境条件的适应能力。叶片栅栏组织内含叶绿体,叶绿体数量随栅栏组织层数的增加而增加。栅栏组织厚度的增加还可加快水分从维管束到表皮的运输速度,从而保证光合作用原料的供应[42]。本研究发现,亮岩镇不同海拔的古茶树叶片栅栏组织与海绵组织分化明显,为典型的异面叶。抗旱性强的古茶树海拔相对较高,其栅栏组织也相对较厚,说明海拔高的古茶树长期受低温和强光的影响,更趋向于分化更多的栅栏组织以增强光合作用从而保护植物免受伤害,这与前人研究[43]基本一致。此外,从叶脉厚度来看,抗旱性较强的古茶树显著高于抗旱性较弱的古茶树,这也可能与其所处的海拔高度有关。随着海拔的不断升高,古茶树叶片可能会伴随生理性缺水的现象发生,为适应这一现象,叶脉增厚以使植物体内水分及营养运输能力和支撑叶片能力提高,这也是植物适应环境变化的体现[44-45]。植物抗旱性是多方面交互作用的结果,进一步研究贵州西北喀斯特区古茶树的抗旱性,还需结合生理生化指标及气候因子综合分析,并从抗旱基因等层面来深入探究。