水通道蛋白4抗体检测细胞系的建立及样本检测

刘 薇,刘改娟,邢龙龙,强亚欣,王丽珊,吕贯廷

(1.河北省健海生物芯片技术有限责任公司,河北 石家庄 050035;2.河北健海医学检验实验室,河北 石家庄 050035)

0 引言

水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)广泛分布于中枢神经系统中,主要介导脑组织中水分子的转运。2004年,Lennon等人[1]证实了在视神经脊髓炎(neuromyelitisoptica,NMO)患者血清中存在一种自身抗体NMO-IgG,该抗体可与脑组织中病变的微血管、软脑膜等部位特异性结合,进而导致视神经脊髓炎谱系疾病的发生。随后,该特异性抗体被证实即为AQP4-IgG抗体。随着研究进一步深入,AQP4-IgG抗体检测开始应用于视神经脊髓炎的临床辅助诊断。在2021版的《视神经脊髓炎谱系疾病诊断与治疗指南》中提到,AQP4-IgG 是具有高度特异性的诊断标志物,特异度高达90%,敏感度约70%,并且指南中推荐使用基于细胞转染的免疫荧光技术(cell based transfection immunofluorescence assay,CBA)或流式细胞技术进行血清检测[2]。

本研究即利用诊疗指南中提到的细胞转染技术构建了AQP4过表达细胞系,之后应用间接免疫荧光技术,建立了样本中AQP4-IgG抗体的检测流程,并对2021年1月至2022年12月本实验室收检的2 241例样本进行了AQP4-IgG抗体检测,之后将检测结果进行分析汇总,分析了AQP4-IgG抗体在中枢神经系统疾病中的阳性率及男女发病占比,并探讨了该抗体在视神经脊髓炎诊疗中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2021年1月至2022年12月本实验室接收的2 241例送检AQP4-IgG抗体的血清及脑脊液样本。男女比例1∶1.28,平均年龄50.44±14.73。

1.2 仪器与设备

力康HealForce二氧化碳细胞培养箱、力康HFsafe1200LC生物安全柜、ZHCHENG恒温振荡培养摇床、BioPard隔水式培养箱、奥林巴斯OLYMPUS BX51荧光显微镜等。

1.3 方法

1.3.1 基因合成

在NCBI数据库中查找AQP4-M23(NM_001364286.1)基因的mRNA序列,由南京金斯瑞公司进行基因序列的合成,质粒载体选用pcDNA3.1(+)-C-eGFP。

1.3.2 质粒提取及验证

将基因合成后的质粒,转化感受态细胞大肠杆菌TOP10,涂板氨苄培养基过夜培养,挑取阳性单克隆进行扩增培养,收集菌体,使用无内毒素质粒提取试剂盒(天根DP118-02)对构建的重组表达载体进行质粒提取。

提取后的质粒进行 NheI 和 EcoRV 双酶切,37 ℃,15 min,80 ℃,20 min使酶失活,酶切体系见表1。同时提取的质粒送擎科生物公司进行测序验证。

表1 双酶切体系

1.3.3 细胞培养及转染

培养Hek293(人胚肾细胞)细胞,达80%～90%融合时,使用Lipofectamine3000转染试剂,按照说明书中步骤转染AQP4基因表达质粒。48 h后,观察转染效果。

1.3.4 细胞固定、通透及爬片封闭

取出转染率达到60%的细胞,使用4% 多聚甲醛对细胞进行结构固定,使用0.2% TritonX-100进行细胞通透,使用3% BSA对细胞爬片进行封闭处理。

1.3.5 一抗验证细胞转染情况

将处理好的细胞爬片与兔单克隆AQP4-IgG抗体(Abcame 货号:ab259318)35 ℃孵育1 h,PBST洗3次后,加入第二抗体TRITC标记的山羊抗兔IgG (Abcame 货号:ab6718)35 ℃孵育1 h,PBST洗3次后,滴加DAPI封片剂,荧光显微镜观察,验证转染及蛋白表达情况。

1.3.6 样本检测

将血清样本1∶10稀释,脑脊液1∶1,与处理后的细胞片孵育1 h,PBS缓慢清洗3遍,使用Cy3标记的抗人IgG抗体(Jacksonimmuno货号:109-165-003)与细胞爬片孵育1 h,PBST洗3遍,取出细胞爬片,滴加DAPI封片剂,荧光显微镜观察并判读记录结果。

1.4 统计学分析

采用SPSS19.0统计软件进行数据处理及统计学分析,计数资料以例数表示,年龄平均数±标准差(X±s)表示,男女组间采用χ2方检验以(n(%))表示,p<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质粒构建验证结果

对质粒进行双酶切验证,测序验证,如图1所示。图1中酶切后的片段大于6 000 bp左右的为质粒载体pcDNA3.1(+)-C-eGFP(6 176 bp),小于1 000 bp的是AQP4的mRNA序列(906 bp)。同时,将质粒送检测序,分析序列结果与理论序列比对符合率100%。

Lane M: KB Ladder

2.2 一抗验证转染及蛋白表达结果

由于质粒载体中构建有EGFP蛋白,因此转染成功的细胞会在荧光显微镜的蓝色激发组(420～485 nm)显示绿色荧光,在荧光显微镜下观测时,可以通过绿色荧光细胞的比例,分析出转染效率。另外,使用第一抗体与细胞孵育,加入红色荧光标记的第二抗体,在显微镜绿色激发组(460～550 nm)下会显示出红色荧光,且红绿荧光可以相对应,如图2所示。

图2 AQP4-IgG抗体验证转染细胞中AQP4蛋白的表达

2.3 细胞法间接免疫荧光阳性样本反应结果

与上述同理,转染成功的细胞在蓝色激发组(420～485 nm)显示绿色荧光,当待检测样本中含有AQP4-IgG抗体时(阳性样本),会与转染细胞表达的AQP4蛋白结合,进而通过Cy3标记的抗human-IgG 第二抗体结合,在荧光显微镜的绿色激发组(460～550 nm)下显示出红色荧光。且绿色荧光与红色荧光位置相对应。当待测样本中不含有AQP4-IgG抗体时(阴性样本),仅能看到细胞表达的EGFP绿色荧光,无红色荧光,如图3所示。

图3 细胞片荧光图(绿色荧光+红色荧光+叠加)

2.4 不同年龄及性别阳性分布情况

对本实验室收检的2 241例样本进行细胞法间接免疫荧光检测,总抗体阳性率为16.15%(362例),男性阳性率为5.8%(57例),女性阳性率为24.23%(305例),男女组间比较采用卡方检验,χ2=138.22,p<0.05,组间差异显著,即女性发病率明显高于男性。平均发病年龄为50.44±14.73。其中男性平均发病年龄51.35±16.82,女性平均发病年龄50.28±14.33,详见表2。

表2 样本阳性率统计

3 讨论

视神经脊髓炎是一种自身免疫性中枢神经系统疾病,具有急性或亚急性脱髓鞘症状,可侵犯视神经与脊髓,单发或复发视神经炎和横贯性脊髓炎。在临床症状上,视神经脊髓炎与多发性硬化有较多相似之处,但治疗原则存在较大差异,因此,视神经脊髓炎早期且准确的诊断,对患者的有效治疗意义重大。随着免疫病理学等学科的不断发展,水通道蛋白4抗体被证实与视神经脊髓炎的发生和发展有重要关系,通过测定患者血清和脑脊液中的抗水通道蛋白4抗体有助于视神经脊髓炎的早期发现及诊断[3]。在2021版的《视神经脊髓炎谱系疾病诊断与治疗指南》中提出,AQP4-IgG是具有高度特异性的诊断标志物,NMOSD中约70%～80%患者AQP4-IgG表达阳性[2]。

水通道蛋白4是由Jung等人[4]于1994年利用水通道蛋白家族的同源性克隆分离获得,结构如图4所示。该蛋白位于细胞膜上,其单体由8个跨膜结构(M1-M8)组成了5个环形结构,有3个环状结构(A、C、E)位于细胞外,两个环状结构(B、D)及羧基、氨基末端位于细胞内,其中 B、E 环含有高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)重复串联序列,2个NPA环折返进出细胞膜的双分子层,构成了亲水通道[5]。AQP4在整个中枢神经系统中的星形胶质细胞上表达丰富,尤其在脑实质与脑室、蛛网膜下腔中脑脊液间的界面处表达水平较高[3]。研究表明,AQP4的功能主要是促进水在血液和大脑之间以及脑和脑脊液(脑脊液)隔间之间的转运。作为一种双向通道蛋白,AQP4在缺血或中毒造成的细胞毒性水肿时,在血脑屏障完整的情况下,可以促进水肿的形成,而在血管源性和间质性水肿时,在血脑屏障已被破坏的情况下,可以清除过多脑积水[6]。

图4 水通道蛋白4结构

研究证实,AQP4-IgG主要是IgG1类抗体[7],该抗体在视神经脊髓炎患者体内的作用机制是抗体可与星形细胞足突表面的AQP4蛋白的胞外段以三维构象的形式非线性结合,激活补体,进而形成膜攻击复合物,损伤星形胶质细胞。研究发现,视神经、脊髓及其他脑组织中AQP4的表达显著高于外周组织,并且可聚集形成体积更大的复合结构,更容易被抗体识别[8]。

鉴于AQP4抗体的检测对于视神经脊髓炎的及早诊断具有重要意义,研究者开始重点关注阳性检出率高且灵敏度好的检测方法。现有的抗AQP4抗体检测方法主要有:基于组织的间接免疫荧光法(TBA)、基于细胞转染的间接免疫荧光法(CBA)、酶联免疫吸附法 (enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。以上方法在实际应用中,各有利弊,TBA和CBA法保证了蛋白的天然构象,但操作相对复杂。在阳性检出率方面,三种方法相比,CBA法的阳性检出率和灵敏度最高。ELISA法较为敏感,但特异度有所降低,指南不推荐作为确立诊断的检测方法,但在纵向监测抗体滴度对疾病进展和治疗的评估方面有一定的价值[3]。我国学者李敏等人[9]研究也发现,在检测视神经脊髓炎患者血清标本和脑脊液标本中的AQP4-IgG抗体时,CBA法的阳性检出率分别为73.1%和 85.1%,IIF的阳性检出率次之,ELISA的阳性检出率较低。结果表明,应将CBA法作AQP4抗体检测的优选方法。

在本研究中,建立了基于细胞学的间接免疫荧光法检测方案,该方法可通过细胞转染的方式,在真核细胞内表达AQP4蛋白,既保证了蛋白的天然构象,又提高了蛋白的表达量,保证了检测的灵敏度,在本实验室的临床样本检测中表现出良好的检测性能。

综上,AQP4-IgG抗体的检测已经成为NMOSD的诊断、治疗和预后的重要参考指标。不断提高 AQP4-IgG 检验方法的灵敏度也成为研究者重点关注的问题,尤其是在疾病早期,及时辅助医生做出准确的诊断,为患者提供最佳治疗时机,在临床应用中具有重要意义。