基于Raf-MEK-ERK 信号通路探究梓醇对蛛网膜下腔出血大鼠脑组织损伤的影响*

孟艳举，王路，王献清，郝志勇

（1.濮阳市人民医院神经外科，濮阳 457005；2.濮阳市人民医院麻醉科，濮阳 457005）

蛛网膜下腔出血（SAH）是一种破坏性的脑卒中，病死率和致残率较高，并伴有脑组织损伤和神经功能障碍，SAH 后发生的早期脑损伤（EBI）被认为是导致SAH 患者预后不良的关键因素[1]。在EBI的各种病理过程中，自噬、细胞凋亡、神经元直接死亡和坏死性凋亡是主要参与过程，其中自噬作为维持细胞和组织稳态的一个重要分解代谢过程，是缺血性细胞损伤中防止细胞凋亡的重要保护机制[2]。已有研究证明，SAH 后激活自噬可抑制EBI 中的神经元凋亡，具有神经保护作用[3]。梓醇具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化和抗细胞凋亡等多种药理作用，在神经系统疾病方面具有较好的治疗作用[4]。研究发现，梓醇对创伤性脑损伤后大鼠的氧化应激和神经炎症具有改善作用[5]，且梓醇可以改善炎症并促进自噬[6]，但梓醇对SAH 脑组织损伤的改善作用与自噬是否有关尚不完全明确。丝裂原活化激酶（MAPK）通过调节丝/苏氨酸蛋白激酶（Raf）-丝裂原活化蛋白激酶（MEK）-细胞外调节蛋白激酶（ERK）级联信号通路，激活ERK 磷酸化，在细胞增殖、凋亡和自噬中起关键作用[7]。由于自噬受Ras/Raf/MEK/ERK信号通路调节，且Raf-MEK-ERK 信号通路参与创伤性脑损伤后海马神经发生[8-9]，由此推测Ras/Raf/MEK/ERK 信号通路可能通过调节自噬改善SAH 后脑组织损伤。而梓醇对SAH 大鼠脑组织损伤的影响与Raf-MEK-ERK 信号通路是否有关尚未有相关报道，研究通过建立SAH 大鼠模型，对其进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级SD 雄性大鼠60 只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004，饲养环境温度22 ℃左右，湿度55%，12 h 光暗循环，不禁水食。

1.2 主要试剂与仪器 梓醇（纯度≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG、伊文思蓝（EB，北京索莱宝公司）；原位末端标（TUNEL）试剂盒、U0126（美国Sigma 公司）；苏木素-伊红（HE）染色液、Triton X-100（上海源叶生物公司）；牛血清白蛋白（BSA）、DAPI（上海爱必信生物公司）；一抗Raf、MEK、磷酸化MEK（p-MEK）、ERK1/2、p-ERK1/2、B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X 蛋白（Bax）、自噬基因Beclin-1、微管连接蛋白轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）和β-actin 抗体（美国赛默飞公司）。光学显微镜，德国徕卡公司；分光光度计，奥地利TECAN 公司。

1.3 模型分组、制备和给药 将大鼠随机分为假手术组、SAH 组、梓醇组、梓醇+U0126 组（梓醇+Raf-MEK-ERK 信号通路抑制剂U0126），每组15 只。采用血管内穿孔法[10]构建大鼠SAH 模型：麻醉大鼠，从颈外动脉残端将锋利的4-0 单丝尼龙缝合线插入右内动脉，刺穿大脑前、中动脉分叉。造模大鼠出现呼吸急促、心率加快等症状，且剥离脑组织可见血性液体散在分布在脑底基底池部位，即为造模成功。假手术组与SAH 大鼠接受相同的手术，但未对血管进行穿孔。造模术后1 h，对各组大鼠进行干预，梓醇组大鼠静脉注射10 mg/kg 的梓醇[5]，梓醇+U0126 组在梓醇组的基础上注射0.05 mg/kg U0126[11]，假手术组和SAH 组注射相同剂量的生理盐水。每天1 次，直至实验结束。

1.4 检测指标

1.4.1 神经功能评估 造模后24 h 采用改良Garcia 法对大鼠进行神经学评分，评估自发活动、四肢运动的对称性、攀爬能力、触觉反应、前爪伸展和身体本体感觉，评分范围3～18 分，评分越高神经功能越好。

1.4.2 SAH 分级 将大鼠脑基底池分为6 部分，其中每部分分级标准如下：0 级：无SAH；1 级：少量SAH；2 级：中度血凝，可见动脉；3 级：血凝块阻塞节段内的所有动脉。等级范围从0～18。SAH 分级评分小于7 分的大鼠，没有明显的脑损伤。

1.4.3 脑组织含水量测定 SAH 后48 h 麻醉处死大鼠，每组取5 只大鼠采用标准干湿法测定脑含水量，取出造模侧大脑称质量以获得湿质量。然后将脑组织在100 ℃干燥24 h 以获得干质量。脑水含量根据公式计算：（湿质量-干质量）/湿质量×100%。

1.4.4 血脑屏障通透性检测 麻醉大鼠，处死前1 h每组取5 只尾静脉注射2% EB 溶液，体内循环1 h后开胸，心脏灌注生理盐水，分离取脑并称质量，脑组织以10 mL/kg 的比例浸入甲酰胺溶液中后匀浆，60 ℃孵育24 h，用分光光度计在620 nm 处测量渗出的EB 染料。

1.4.5 HE 染色观察脑组织病理变化 取大鼠脑组织CA1 区，每组5 只，部分固定于4%多聚甲醛中（剩余冻存至-80 ℃），石蜡包埋，切片（5 μm）后用HE 染色，在光学显微镜下观察。

1.4.6 免疫荧光染色 取上述部分脑组织CA1 区切片，用Triton X-100 处理后BSA 封闭，将样品与TUNEL 试剂盒、一抗p-ERK1/2、LC3-Ⅱ（1∶1 000）在4 ℃孵育过夜，洗涤后与荧光二抗在37 ℃下孵育1 h。并用DAPI 进行核染，在显微镜下观察拍照，使用Imagepro Plus 6.0 分析结果，并计算平均光密度（AOD）值。

1.4.7 蛋白免疫印迹（Western blot）检测蛋白表达 取上述冻存至-80 ℃的CA1 区脑组织，裂解后提取总蛋白，定量后按步骤将蛋白SDS-PAGE 电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，在4 ℃下加入一抗Raf、MEK、p-MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax、Beclin-1、LC3-Ⅱ（1∶1 000）和内参β-actin 过夜孵育，清洗，在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000），孵育2 h。用ECL 发光显影，观察拍照，各条带灰度值用Image J 软件处理分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS 26.0 软件进行统计分析，数据采用均数±标准差（±s），多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠神经功能评分和SAH 分级比较 与假手术组相比，SAH 组大鼠神经功能评分减少，SAH 分级显著增加（P＜0.05）；与SAH 组相比，梓醇组大鼠神经功能评分增加，SAH 分级显著减少（P＜0.05）；与梓醇组相比，梓醇+U0126 组大鼠神经功能评分减少，SAH 分级显著下降增加（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分和SAH 分级比较（±s）Tab.1 Comparison of neurological function score and SAH grade in each group（±s）

表1 各组大鼠神经功能评分和SAH 分级比较（±s）Tab.1 Comparison of neurological function score and SAH grade in each group（±s）

注：与假手术组相比，*P＜0．05；与SAH 组相比，#P＜0．05；与梓醇组相比，△P＜0．05。

组别动物数神经功能评分（分） SAH 分级（级）假手术组1517．48±2．590．73±0．08 SAH 组159．72±2．24*14．06±1．59*梓醇组1515．39±2．01#5．28±0．72#梓醇+U0126 组158．31±1．55△15．65±1．63△

2.2 大鼠脑组织含水量和血脑屏障检测结果 与假手术组相比，SAH 组大鼠脑组织含水量、EB 渗出量显著增加（P＜0．05）；与SAH 组相比，梓醇组大鼠脑组织含水量、EB 渗出量显著减少（P＜0．05）；与梓醇组相比，梓醇+U0126 组大鼠脑组织含水量、EB渗出量显著增加（P＜0．05）。见表2。

表2 各组大鼠脑组织含水量和血脑屏障比较（±s）Tab.2 Comparison of brain water content and blood-brain barrier in each group（±s）

表2 各组大鼠脑组织含水量和血脑屏障比较（±s）Tab.2 Comparison of brain water content and blood-brain barrier in each group（±s）

注：与假手术组相比，*P＜0．05；与SAH 组相比，#P＜0．05；与梓醇组相比，△P＜0．05。

组别动物数脑组织含水量（%） EB 渗出量（μg/g）假手术组572．58±6．313．74±0．38 SAH 组582．53±7．42*13．09±1．42*梓醇组570．39±6．18#7．28±1．05#梓醇+U0126 组585．35±7．01△14．62±0．95△

2.3 大鼠脑组织HE 染色结果 假手术组海马CA1 区神经元细胞形态正常，排列整齐，未观察到明显变性或坏死；SAH 组神经元细胞排列相对松散，许多核固缩和核仁消失体积较小，染色较深，细胞数目减少；梓醇组神经元损伤明显减轻，结构相对整齐，细胞死亡较少；梓醇+U0126 组相比于梓醇组神经元损伤加重。见图1。

图1 大鼠海马CA1 区HE 染色图（×400）Fig.1 HE staining of rat hippocampal CA1 region(×400)

2.4 大鼠神经元细胞凋亡结果 与假手术组相比，SAH 组TUNEL 阳性细胞数目增加，凋亡率升高（P＜0．05）；与SAH 组相比，梓醇组TUNEL 阳性细胞数目减少，凋亡率降低（P＜0．05）；与梓醇组相比，梓醇+U0126 组TUNEL 阳性细胞数目增加，凋亡率升高（P＜0．05）。见图2 和表3。

图2 大鼠神经细胞凋亡情况（×400）Fig.2 Neuronal apoptosis in rats(×400)

表3 大鼠神经元细胞凋亡率（±s）Tab.3 Neuronal apoptosis rate in rats（±s） %

表3 大鼠神经元细胞凋亡率（±s）Tab.3 Neuronal apoptosis rate in rats（±s） %

注：与假手术组相比，*P＜0．05；与SAH 组相比，#P＜0．05；与梓醇组相比，△P＜0．05。

组别动物数凋亡率假手术组52．39±0．27 SAH 组537．42±3．84*梓醇组512．57±1．68#梓醇+U0126 组541．08±2．37△

2.5 大鼠p-ERK、LC3-Ⅱ免疫荧光表达结果 与假手术组相比，SAH 组的LC3-Ⅱ、p-ERK 神经元阳性表达显著增强；与SAH 组相比，梓醇组LC3-Ⅱ、p-ERK 神经元阳性表达进一步增强；与梓醇组相比，梓醇+U0126 组LC3-Ⅱ、p-ERK 神经元阳性表达减弱（P＜0．05）。见图3、图4 和表4。

图3 大鼠脑组织CA1 区LC3-Ⅱ表达（×400）Fig.3 Expression of LC3-Ⅱin CA1 region of rat brain tissue(×400)

图4 大鼠脑组织CA1 区p-ERK 表达（×400）Fig.4 Expression of p-ERK in CA1 region of rat brain(×400)

表4 大鼠脑组织CA1 区LC3-Ⅱ、p-ERK 阳性表达情况（±s）Tab.4 Positive expression of LC3-Ⅱand p-ERK in CA1 region of rat brain tissue（±s）

表4 大鼠脑组织CA1 区LC3-Ⅱ、p-ERK 阳性表达情况（±s）Tab.4 Positive expression of LC3-Ⅱand p-ERK in CA1 region of rat brain tissue（±s）

注：与假手术组相比，*P＜0．05；与SAH 组相比，#P＜0．05；与梓醇组相比，△P＜0．05。

组别动物数LC3-Ⅱp-ERK假手术组54．81±1．093．17±0．72 SAH 组516．24±1．57*15．27±1．63*梓醇组521．75±2．08#23．19±2．16#梓醇+U0126 组56．51±1．26△4．28±0．91△

2.6 大鼠自噬和凋亡蛋白表达比较 与假手术组相比，SAH 组Bax、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达升高，Bcl-2 表达降低（P＜0．05）；与SAH 组相比，梓醇组Bax 蛋白表达降低，Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ表达升高（P＜0．05）；与梓醇组相比，梓醇+U0126 组Bax蛋白表达升高，Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ表达降低（P＜0．05）。见图5 和表5。

图5 大鼠自噬和凋亡蛋白表达变化Fig.5 Changes of autophagy and apoptosis protein expression in rats

表5 大鼠自噬和凋亡蛋白表达比较（±s）Tab.5 Comparison of autophagy and apoptotic protein expression in rats（±s）

表5 大鼠自噬和凋亡蛋白表达比较（±s）Tab.5 Comparison of autophagy and apoptotic protein expression in rats（±s）

注：与假手术组相比，*P＜0．05；与SAH 组相比，#P＜0．05；与梓醇组相比，△P＜0．05。

组别动物数BaxBcl-2Beclin-1LC3-Ⅱ假手术组50．81±0．09 1．05±0．11 0．91±0．12 1．01±0．11 SAH 组51．42±0．10* 0．58±0．08* 1．36±0．15* 1．42±0．17*梓醇组50．91±0．08# 0．92±0．09# 1．68±0．16# 1．95±0．21#梓醇+U0126 组51．55±0．11△ 0．51±0．06△ 1．08±0．14△ 1．06±0．15△

2.7 大鼠Raf-MEK-ERK 通路蛋白表达比较 与假手术组相比，SAH 组Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2 蛋白表达升高（P＜0．05）；与SAH 组相比，梓醇组Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2 蛋白表达进一步升高（P＜0．05）；与梓醇组相比，梓醇+U0126 组Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2 蛋白表达降低（P＜0．05）。见图6 和表6。注：A．假手术组；B．SAH 组；C．梓醇组；D．梓醇+U0126 组。

图6 大鼠Raf-MEK-ERK 通路蛋白表达变化Fig.6 Changes of Raf-MEK-ERK pathway protein expression in rats

表6 大鼠Raf-MEK-ERK 通路蛋白比较（±s）Tab.6 Comparison of Raf-MEK-ERK pathway proteins in rats（±s）

表6 大鼠Raf-MEK-ERK 通路蛋白比较（±s）Tab.6 Comparison of Raf-MEK-ERK pathway proteins in rats（±s）

注：与假手术组相比，*P＜0．05；与SAH 组相比，#P＜0．05；与梓醇组相比，△P＜0．05。

组别动物数Rafp-MEK/MEK p-ERK1/2/ERK1/2假手术组50．38±0．040．47±0．060．57±0．06 SAH 组51．25±0．13* 1．31±0．12*0．98±0．09*梓醇组51．49±0．15#1．55±0．17#1．46±0．14#梓醇+U0126 组50．54±0．10△ 0．62±0．09△0．71±0．09△

3 讨论

EBI 是SAH 患者急性脑损伤和神经功能障碍的最重要原因[12]。神经元死亡被认为是EBI 的主要原因，可引发细胞毒性水肿和血脑屏障破坏。因此，减少神经元死亡的数量可改善SAH 患者预后。研究发现，SAH 大鼠神经元细胞数目减少，神经功能评分下降，SAH 分级、脑组织含水量、血脑屏障通透性升高，表明SAH 后发生脑水肿，出现神经功能障碍和脑损伤。梓醇具有神经保护作用，能有效改善急性脑缺血大鼠神经功能障碍和脑水肿，减少脑细胞凋亡[13]。研究SAH 大鼠经梓醇干预后，神经元细胞数目增加，神经功能评分升高，SAH 分级、脑组织含水量、血脑屏障通透性下降，表明梓醇能改善SAH后脑水肿，改善神经功能障碍和脑损伤。

神经元凋亡是SAH 后血肿的机械压迫，血红蛋白的毒性损伤和氧化应激导致的，可引发EBI 各种过程，是SAH 患者预后不良的关键因素。研究表明，抑制细胞凋亡，可改善SAH 后的EBI[14]。研究发现，SAH 大鼠神经元细胞凋亡增加，促凋亡蛋白Bax 表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2 表达降低，而梓醇干预后神经元细胞凋亡减少，表明梓醇能减少SAH 大鼠神经元凋亡。自噬是一种高度调控的细胞内成分的降解方式，在多种中枢神经系统疾病中发挥重要作用，在SAH 中发现自噬激活可以减少神经元凋亡，而抑制自噬会加重神经元凋亡[15]。研究发现，SAH 大鼠自噬标志物Beclin-1、LC3-Ⅱ表达增加，而梓醇干预后Beclin-1、LC3-Ⅱ表达进一步增加。且有研究发现梓醇可通过增强自噬来改善糖尿病肾病足细胞损伤[16]，表明梓醇可能通过促进SAH 大鼠自噬，减少神经元凋亡。

MAPK 是一类广泛存在于哺乳动物细胞中的激酶参与细胞生长、发育、分化、凋亡和细胞间功能同步等多种过程[17]。Raf/MEK/ERK 信号通路通过磷酸化上游Raf 分子激活下游分子ERK，将信号从膜传递到细胞内参与调节生理和病理过程中的细胞分裂、增殖、自噬和凋亡等[7]。ERK 在SAH 引发的脑损伤中发挥重要作用，通过激活MEK/ERK 通路并上调其蛋白表达增强突触可塑性，改善SAH 后脑损伤[18]。Raf/MEK/ERK 通路在细胞凋亡和自噬中都起关键作用，Li 等[19]发现通过激活Raf/MEK/ERK 介导的细胞自噬可减轻脂多糖引起的鼠肾足细胞凋亡。此外，Sun 等[20]发现骨桥蛋白通过黏着斑激酶（FAK）-ERK 途径增强自噬改善大鼠SAH 后的EBI。研究中SAH 组Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2 表达升高，Raf/MEK/ERK 通路激活，梓醇进一步促进Raf/MEK/ERK 通路的激活，与自噬蛋白表达趋势一致。且ERK 抑制剂U0126 逆转了梓醇对SAH 大鼠脑损伤的改善作用，表明梓醇可能是通过激活Raf/MEK/ERK 信号通路发挥对SAH 后脑损伤的改善作用。

综上所述，梓醇能改善大鼠SAH 后脑损伤，减少细胞凋亡和神经功能障碍，其作用机制可能与激活Raf/MEK/ERK 信号通路而增强自噬有关。该研究为改善SAH 后脑损伤提供了新思路，但梓醇对大鼠SAH 后脑损伤的其他分子机制仍有待阐明。