基于科研成果转化的超分辨显微成像教学实验设计

黄幼萍 陈小钢

摘要：为培养创新应用型工程人才，融合专业基础知识与教师科研成果，利用MATLAB GUI强大的计算和人机交互功能构建STED超分辨显微成像仿真实验平台。通过GUI界面可以方便地进行各项参数设置和可视化入射光像差和偏振态对超分辨效果的影响，具有良好的可操作性和交互性。借助该仿真实验摆脱了实验仪器、场地等束缚，解决了实验装置复杂、设备昂贵等问题，为实验教学提供了一种可视化手段，同时还实现了基础理论与前沿技术的融会贯通，使学生充分认识和掌握高新技术，为拔尖创新人才提供了重要的培养途径。

关键词：科研成果；教学实验；STED超分辨显微成像；MATLAB GUI；创新能力

中图分类号：G642      文献标志码：A      文章编号：1008-4657（2023）04-0077-08

0        引言

科技创新是促进人类社会发展的重要推手，而创新型人才则是科技创新的引领者。高校是培养创新型人才的重要基地，在新工科建设背景下，如何培养具备科学意识、创新理念和实践能力的高素质工程应用型人才，以适应光电企业的发展，成了各个高校光电专业教学改革探索的首要任务。实验教学是培养工程应用型人才的有效途径，而传统的光学实验教学大多以测量类和验证性为主，内容相对陈旧，与前沿科技脱轨，不利于激发学生的科研创新潜能和综合能力。将教学与科研紧密融合不仅可以丰富教学内容，而且对锻炼学生的科研能力和创新能力具有显著的指导意义，是教学改革中的重要举措［ 1-3 ］。为此，许多高校鼓励教师立足于科研实践，将教师科研成果融入到本科实验教学中。

光学显微镜是一种精密光学仪器，具有无损、快速成像的特点，在生物学、医学、材料学等领域具有重要的应用价值［ 4 ］。由于光学衍射极限的存在，显微镜的成像分辨率被限制在200 nm左右（约为可见光波长的一半），因此无法看清小于衍射极限的物体，如病毒。超分辨显微技术因可以突破衍射极限，成为了目前光学研究的前沿科技和最新领域［ 5-7 ］。然而目前超分辨显微镜系统复杂、造价昂贵，动辄成百上千万，并不是普通院校所能负担得起的。因此，不能在本科教育中开展超分辨显微技术实物实验，严重限制了普通本科院校光电专业学生接触光学前沿技术的机会。

利用虚拟仿真实验，能够对难以用实际实验操作或无法进行拆分展示内部结构的光学仪器进行仿真，从而脱离实际实验仪器的束缚，丰富光学教学手段，搭建适合线上学习的实验教学平台，实现更好的教学效果［ 8-9 ］。本实验通过结合教师科研成果，利用MATLAB  GUI构建虚拟受激辐射淬灭（Stimulated Emission  Depletion， STED）超分辨显微成像实验仿真，研究入射光像差、偏振态等相关参数对STED超分辨显微成像的影响，通过可视化其原理和实验结果，有利于学生对前沿显微技术概念的建立，实现基础理论与前沿技术的融会贯通，使学生充分理解和掌握高新科技手段，以前沿科技促进学生创新思维和能力的培养。此外，将超分辨技术纳入光电专业虚拟实验建设还可为后续开展线上课程提供实验技术支持，丰富了光电课程教学手段，进一步促进线上线下教学的有机融合。

1        受激辐射淬灭（STED）超分辨显微成像技术原理

由于光的本质是电磁波，当以点光源经过显微系统后会发生衍射现象，从而形成一个弥散的图案，即艾里斑。若两个经过光学系统成像后形成的衍射光斑靠得很近时，则会出现不能被分辨的情况。1873年，Abbe等建立了光学衍射与系统分辨率之间的关系，即：

式中，λ为入射光的波长，NA  =  nsinθ为显微物镜的数值孔径。从公式（1）可知，入射光波长和物镜的数值孔径决定了显微镜的分辨率。因此对于光学显微系统来说，可以通过增大数值孔径的方法来提高分辨率，如：固态浸没透镜（SIL）技术、4Pi显微技术等。这些方法本质上是提高系统的截止频率，但由于材料的限制，对分辨率的提升较为有限，不能真正突破光学衍射极限。

提高光学系统分辨率的另一个方法就是压缩系统点扩展函数，使衍射形成的弥散斑尽量的小，该领域典型技术代表就是受激辐射淬灭超分辨显微技术（STED）。1994年，Hell S W等［ 10 ］考慮到衍射极限的限制主要是由于聚焦的光斑尺寸不能无穷小造成，理论上，如果能缩小激光光斑就可以实现超分辨成像。其基本思想是，在一个正常激发光点扩展函数的基础上，用另一个环形光去擦除激发光的外围，从而使得激发光斑的点扩散函数变小，其设想实验装置如图1（a）所示。根据自发辐射和受激辐射产生的光波长不同（如图1（b）所示），Hell用位相板产生环状的激光光斑并套在激发光斑外，使激发光外围的荧光分子发生受激辐射而非自发辐射，再用二向色镜区分受激辐射跟自发辐射波长，从而只剩下环形光斑中心的荧光，其强度分布如图1（c）所示。

由于这一方法所产生的点扩展函数不再受到衍射极限的限制，而仅仅取决于环形光强度。基于此，阿贝衍射极限分辨率可改写为：

式中，Is是饱和受激辐射的激光强度，IdeMAX是STED环形光的最大强度。理论上，随着Ide强度的增加，STED技术的分辨率可以无限缩小。

2    基于MATLAB GUI的STED超分辨显微成像技术仿真设计

MATLAB 是美国Mathworks推出的一款功能强大的数值仿真软件，它具有数值分析、矩阵运算、图形处理、仿真建模等功能。对比于C语言和Python等编程软件，利用MATLAB软件进行光学实验的仿真，只需要用数学公式表达和建模，省去了大量繁琐的编程过程，使学生有更多的时间和精力去探究科学问题本身。此外，基于MATLAB丰富的作图能力和GUI（图形用户界面）技术，能够轻松数据可视化，有助于学生化抽象思维为形象思维。基于此，利用MATLAB进行受激辐射淬灭超分辨显微成像技术仿真，不仅能够摆脱实验设备昂贵和系统复杂性的限制，而且效果比实验更形象直观，进一步增强了学生的感性认识和创造性。

2.1    激发光和STED光的数学表征

如图1（a）所示，典型STED超分辨显微成像系统中采用两束激光激发。其中一束为正常的激发光束，一般采用脉冲或者连续激光。另一束由激发光经过一个0 - 2π的螺旋相位板生成一个具有“甜甜圈”结构的环形光斑，称为STED光束。最后，激发光束和STED光束利用一个二向色镜耦合成一束光，并经过高数值孔径（NA）的显微物镜聚焦在成像平面上。

在典型STED显微系统中，激发光束在入射平面一般满足典型高斯光束分布，即：

其中，A0为入射光振幅系数。γ取决于系统入瞳与光束束腰半径的比值，为了充分利用激光功率，理论上光束束腰应填满入瞳，即γ = 1。α为物镜的最大半孔径角（θmax = α），而最大半孔径角满足NA = nsinθmax。高斯光束经高NA物镜聚焦后的电场矢量分布E（r2， φ2， z2）可以由矢量Debye衍射理论得到，即［ 11 ］：

其中，C为系统常数，由显微物镜和入射光波长决定。k为波矢常数（k = 2π/λ），n为聚焦空间的介质折射率。（r2， φ2， z2）为聚焦点处的柱坐标参数。A（θ，φ）代表系统的初级像差函数，五种初级像差函数表达式如表1所示［ 12 ］。

对于STED光束，由于在光路中插入了一个0-2π螺旋相位板，因此其聚焦点的光场分布为：

Ede（r2， φ2， z2） = Eex（r2， φ2， z2）·exp（iφ）（6）

其中，exp（iφ）表示由螺旋相位板引入的相位延迟，φ取值在0和2π之间。

最终，焦点处的强度分布则为：

I（r2， φ2， z2） = |E（r2， φ2， z2）|2（7）

通过激发光与STED光束调制后的荧光强度表达式为：

式中，Is为荧光饱和强度。STED系统的分辨率则由公式（2）表示。

2.2    GUI界面设计

GUI全称为图形用户界面，是一种高效便捷的人机交互方式。在MATLAB中，将数值分析、矩阵计算、建模和仿真等功能集成在一个GUI界面中，方便用户进行操作，很大程度上摆脱了传统非交互式程序设计语言的编辑模式。基于GUI操作界面，用户可以跳过繁冗的代码编辑和繁杂的数学运算，实现计算结果和编程的可视化，有利于操作和观察。

具体设计思路包括：

仿真界面包括展示图片按钮，运行时可以在GUI界面内打开图片，从而实现对系统原理和光路图的展示。通过在GUI界面插入按钮组件作为显示开关，执行回调函数，回调函数中采用uigetfile + imread + imshow组合，进行文件夹选择，读取和显示图片。

仿真界面上使用文本文字给出参数名称，同时设计可编辑文本框作为参数变量输入口，通过相关按钮组件进行启动执行回调程序，输入框参数作为回调函数中变量，注意全局变量和局部变量的运用。

根据激发光和STED光定义式编写回调函数，利用MATLAB强大的数据处理和绘图能力，给出不同参数下的模场分布图。

3    仿真结果

3.1    理想状态下STED超分辨成像技术

基于MATLAB GUI界面，能够快速、便捷的获得和可视化不同参数下的仿真结果。

首先，通过点击GUI界面的原理和光路展示按钮，系统将给出关于STED超分辨显微镜技术的文字原理介绍和图1所示光路图，有助于理解超分辨显微技术的原理与光路。

其次，通过在仿真界面设置不同的NA值、折射率n、入射光波长、强度、荧光饱和强度等参数，以及通过选择激发光和STED光的不同偏振态和像差系数，能够进一步探究不同参数对超分辨成像的影响。例如，将参数设置为：NA = 1.4，n = 1.5，λex = 635 nm，λde = 760 nm，入射光强度Iex = 1mW/cm2，Ide = 10 mW/cm2，荧光饱和强度IS = 1mW/cm2，激发光偏振态选择X线偏振，STED光选择右旋圆偏振，假设系统为理想成像，此时像差系数为1，即无像差。设置完参数后点击界面的光强图按钮，仿真系统将计算出激发光、STED光和超分辨荧光在XY平面的光强分布图，效果如图2所示。图2（a）为激发光的光强分布图，拟合其半高全宽为248.7 nm，超过衍射极限（200 nm）。图2（b）为通过螺旋相位板生成的STED光强分布图，由图可知其中心光强为零，分布呈环形对称。将激发光与环形光耦合在一起时，最终将获得如图2（c）所示的调制后的荧光光强分布。此时，调制后光斑的半高全宽为141.8 nm，突破了衍射极限限制，如图2（d）所示。

3.2    像差对于STED超分辨显微技术的影响

在此基础上，通过选择不同的参数，可进一步探究STED超分辨技术的影响因素，如探究像差和入射光偏振对STED光的影响。作为STED技术中最为重要的调制光，STED光的形状和强度分布决定了系统分辨率，因此探究其影响因数具有重要的研究意义。理论上，STED光应该具有完美的环形“甜甜圈”结构，其中心強度为0，且其强度越大系统分辨率越高。但在实际成像过程中，由于光学系统往往存在像差，因此STED光的形状和光强分布将会受到影响。在仿真系统中，通过在GUI仿真界面上，选择不同像差系数，对STED光强分布进行计算，其结果如图3所示。

对比于理想成像下的STED光强分布可以看出，球差和场曲不会改变STED光环形结构特征，但会使光环的直径变大同时降低了其最大光强，如图3（b）和（c）所示。畸变不会改变STED光的环形结构特征和光强分布，但是会使整个光环位置发生平移，这样会影响成像时与激发光的对准耦合，如图4（d）所示。此外，彗差和像散同时改变了STED光的环形对称分布和强度分布，会对STED光产生严重影响，进而影响系统的成像分辨率极限，如图3（e）和（f）所示。

从仿真结果来看，常见的五种初级像差都会对STED光成像产生影响，特别是彗差和像散，因此在实际实验中应该尽量避免各类像差的产生，如对光路搭建过程中的等高共轴调节、成像视场控制等。

3.3    入射光偏振态对STED超分辨显微技术的影响

像差对STED光会产生影响外，入射光的偏振态也是影响STED光形状和强度分布的重要因素。在虚拟仿真实验平台界面上通过设置不同的入射光偏振参数，可以进一步探究偏振态的影响。不同偏振态的STED光强分布如图4所示。

从图4的仿真结果可以看出，右旋圆偏振光经过0 - 2π相位板产生的STED光的环形结构和光强分布最完美，如图4（c）所示。X线偏和Y线偏产生的环形光会有两个比较亮的旁瓣，方向分别沿着X方向和Y方向，如图4（a）和（b）所示。以X和Y方向为长轴的椭圆偏振可以产生比線偏振更好的圈斑，但其强度分布不均匀，如图4（e）和（f）所示。当输入光束采用左旋圆偏振时，其聚焦后的光斑中心强度不为0，这样会对激发光中心光强也进行抑制，因此不适合用于超分辨成像，如图4（d）所示。当输入光束采用径向偏振或角向偏振时，其聚焦后的光斑不再具有环形甜甜圈结构，而是成为一个类似高斯光斑聚焦点，如图4（g）和（h）所示。

通过仿真分析，可以得到如下结论：左旋圆偏振、径向偏振和角向偏振并不适合用于产生STED光束，而右旋圆偏光为最佳入射光偏振态，为实验研究提供了重要的理论支撑。

3.4   STED超分辨显微成像效果

最后，通过点击GUI界面的成像按钮，系统将给出徕卡公司通过共聚焦显微镜与STED超分辨显微镜得到的多色共标记的复杂细胞骨架网络和转运囊泡的显微图像，如图5所示［ 13 ］。

常见细胞骨架包括微管、微丝、中间纤维等，其尺寸在200 nm以内，采用一般光学显微镜无法观测到细胞骨架的细节结构。从图5可以看出共聚焦显微技术的分辨率较差，无法分辨细微细胞骨架网络和转运囊泡，而STED显微镜能获得超越衍射极限的分辨率，能清楚分辨出细胞骨架网络和转运囊泡。通过显示成像图像的对比，能够更直观和深入的了解超分辨技术的成像效果。

4    结束语

本实验通过融入教师科研成果，帮助学生接触和充分了解前沿技术，培养了学生的创新意识，开拓学生的创新思维。利用MATLAB GUI设计了STED虚拟仿真实验平台，借助该虚拟仿真实验平台，学生能够学习和掌握STED超分辨技术原理和特点。此外，通过设置不同仿真参数，比较和分析不同条件下的输出结果，使学生更加深入地理解各项参数对超分辨成像技术影响（如像差和偏振对STED环形光的影响）。在此基础上，引导学生进行更深入的科学研究与探索，将理论、仿真与实践结合在一起，进一步培养学生的科学研究兴趣和创新能力。该仿真系统界面具有简洁易懂、操作方便、计算结果图形化和可视化的特点，将其应用于光电专业前沿技术的辅助教学，不仅可提高教学质量，同时为后续开展线上课程提供实验技术支持，丰富了光电课程教学内容和手段，有效促进线上线下教学的有机融合。

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Experiment Design of Super-resolution Microscopic

Imaging Technique Based on Scientific Research

HUANG Youping，CHEN Xiaogang

（Department of Electronic Information Science， Fujian Jiangxia University， Fuzhou 350108， China）

Abstract：In order to cultivate innovative and practical engineering talents， a stimulated emission depletion （STED） super-resolution microscopy simulation experiment platform is proposed with MATLAB GUI by integrating of professional knowledge and research results. A parameter study was carried out to investigate the influence of the incident light aberration and polarization state on the super-resolution imaging. Through the GUI interface， it is easy to set parameters and visualize simulation results with good operability and interactivity. The simulation experiment can provide a visualization method for experimental teaching without the constraints of sites and complicated and expensive instruments. Besides， it realizes the integration of basic theory and cutting-edge technology， enables students to fully understand and master high technology， and provides an important way for the cultivation of top-notch innovative talents.

Key words：scientific research achievement；simulation experiment；STED super-resolution microscopy imaging；MATLAB GUI；innovation capability