一株长颈鹿金黄色葡萄球菌感染的分离鉴定

周飘，汤德元，曾智勇，陈旭，袁盛林，廖正波，毛茵茗，何松

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

最近几年来葡萄球菌感染现象急剧升高引起人们的广泛关注，自然环境中极为广泛地分布着葡萄球菌，细菌能透过多个途径传染，裂开、受损皮肤，黏膜是主要的入侵途径。严重时可造成菌血症、败血症。在葡萄球菌属中，金黄色葡萄球菌是一种最主要的病原体，它容易引起血管内感染、坏死性肺炎、心内膜感染等各内脏器官的严重感染。而此例长颈鹿感染金黄色葡萄球菌后表现的症状不明显，出现突发性死亡。

长颈鹿：一种非洲的反刍偶蹄动物，拉丁语的意思是“身上有豹子斑点的骆驼”。它是目前世界上最大的陆生动物，生活在非洲热带、亚热带稀树大草地上。贵州野生动物园内，一只长颈鹿在2022 年5 月中旬突然死亡，根据其临床表现、病理组织学的改变，进行了实验室诊断，明确长颈鹿死因可为长颈鹿的疾病预防和以后的繁殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

贵州省贵阳市扎佐野生动物园病死长颈鹿的肺、心、肝、肠道和肾脏等组织。

1.2 剖检

对病死长颈鹿病理解剖，观察肺、心、肝、肠道、胰腺、肾和其他组织的病理变化。

1.3 细菌分离纯化及镜检

利用超净台，使用无菌接种环于病死长颈鹿的心、肝、肺、肠道、胰腺和肾脏等处取样，样品在TSA 固态培养基（广东环凯微生物科技有限公司）上做“Z”字划线培养，然后在37℃下摇床，24 小时后把TSA 固态培养基中的单菌落移入FTG 固态培养基（可从广东环凯微生物科技有限公司购买），把培养基放入37℃的水浴摇床中，在摇床上过夜，并每24 小时对其进行检测，观察并记录金黄色葡萄球菌生长变化情况，之后吸取细菌菌液涂片，使用酒精灯外焰干燥固定，革兰氏染色法染色镜检。

1.4 细菌培养及染色

使用无菌接种环采集肝、肺、胰腺、肾进行需氧和厌氧的血平板和LB 培养基培养24～48小时，可观察到大量菌落生长，使用革兰氏染色法对单菌落染色，观察并记录结果。

1.5 细菌分子生物学鉴定

利用超净工作台，参考说明书，使用细菌基因DNA 萃取试剂盒（可从北京天根生化科技有限公司购买），提出一种菌液DNA，可用于16S rDNA PCR 扩增的模板，依据相关参考文献合成16S rDNA 基因序列引物。16S rDNA 引物27F:5′-3′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R: 5′-3′GGTTACCTTGTTACGACTT，扩增的基因片段大约是1 500 bp。采用以下PCR 反应体系扩增16S rDNA 基因的目的片段，如下：分别为1 微升上游引物和1 微升下游引物，2 微升细菌DNA，21 微升mix 合成完整的整个25 微升体系。PCR 预变性反应温度：98℃，时间：10 分钟；98℃变性，时间：30秒；50℃退火，时间：30 秒；72℃延伸，时间：1 分钟；完成35 个循环；在72℃下，最后再延伸10 分钟。将PCR 产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，按照说明书上的步骤，用胶回收工具将PCR 产物中的目标条带提取出来，并送往擎科生物进行序列测定。取5微升胶回收产物，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，对提取的产物进行了初步的鉴定，并在-20℃冰箱保存。

图1 血平板厌氧培养结果

图2 LB培养基培养结果

1.6 细菌的生化特性鉴定

参考细菌的生化鉴定管说明书按步骤操作（购买方式-青岛海博生物技术有限公司），利用超净工作台，将经过筛选和提纯的细菌溶液接种在生化鉴定试管上，进行测定，分别有葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、蔗糖、木糖、蔗糖、山梨醇、鼠李糖、丙二酸盐、肌醇、西蒙氏枸橼酸盐、尿素、β-半乳糖苷(ONPG)、七叶苷、水杨素、葡萄糖磷酸盐胨水、鸟氨酸脱羧酶、葡萄糖铵、葡萄糖酸盐、赖氨酸脱羧酶、绵子糖、苯丙氨酸、明胶、硫化氢、硝酸盐、氰化钾、半乳糖生长试验管等，将其放置在37℃的培养箱中，24 小时后，对其进行观察并将其结果记录下来。

1.7 药敏试验

在TSA 平板上均匀涂覆分离纯化的金葡菌，选择一系列药敏纸片：麦迪霉素、环丙沙星、万古霉素、利福平、新霉素、大观霉素、头孢氨苄、林可霉素、阿莫西林、新生霉素、青霉素G、恩诺沙星、呋喃唑酮、卡那霉素、四环素、头孢他啶、复方新诺明等药物（购买方式--杭州微生物试剂有限公司），将药物敏感纸附着在固态培养基上，并标注出药物敏感的种类，具体的操作方法按照说明书进行，将含有药物敏感纸片的培养基放入37℃的培养箱中进行无氧培养，24～48 小时后进行观察。

2 结果

根据临床症状及实验室诊断结果表明，该长颈鹿感染金黄色葡萄球菌，症状疑似金黄色葡萄球菌产生的TSST （中毒性休克综合征毒素）导致长颈鹿中毒性休克综合征，该病毒因子可通过增加内毒素的敏感性，引起心血管絮乱而休克死亡。

2.1 剖检结果

病死长颈鹿皮下无出血点，胃膜正常，肠系膜无出血点，腹腔无积液，肠端无胀气，脾脏无病变，肺部瘀血并伴出血点、出现间质性水肿和肺泡性水肿，心脏存有心包积液，由于病鹿长期卧地不起，关节肿大，触摸四肢有波动感，关节液增加，呈化脓性关节炎。

2.2 细菌形态观察

培养24～48 小时后，LB 培养基大量菌落生长，用革兰氏染色法对分离和提纯的细菌进行染色，可见革兰氏阳性菌呈球状（见图3），直径约1微米，多个球菌不规则地堆在一起，形似葡萄串，初步鉴定为金黄色葡萄球菌。

图3 菌落镜检染色结果

2.3 细菌分子生物学鉴定结果

以纯化细菌基因组为模板，用16S rDNA 特异性引物对产物进行扩增后利用1.5%琼脂糖凝胶电泳方法，得到大约1500 bp 的目标条带（图4），和目标片段的序列长度大致相同。将PCR 得到的产物进行测序后于NCBI 中，用BLAST 进行比较分析，测序得到的结果表明：此序列与GenBank 中的金黄色葡萄球菌16S DNA 基因序列同源性高达100% ，证实其为金黄色葡萄球菌。

图4 PCR电泳结果

2.4 生化试验结果

其结果是：该菌株对蔗糖、葡萄糖等反应呈阳性, 对明胶、棉子糖等反应呈阴性（表1）。

表1 生化试验结果

2.5 药敏试验结果

药敏结果表明：环丙沙星、麦迪霉素、利福平、万古霉素抗菌区直径普遍大于20 毫米（表2），说明上述药物对金葡菌有很好的抑菌效果。

表2 药敏试验结果

3 讨论

采用细菌分离鉴定，生化检测，PCR 技术及药物敏感性试验对该病例进行了研究，分离纯化得到一株金黄色葡萄球菌。葡萄球菌属在自然界中分布广泛，人和动物的带菌率很高，污水、土壤、空气、尘埃都有葡萄球菌存在，而且，这种细菌对环境没有任何特殊的要求，很难清除。葡萄球菌属共有28 个种，有些种能对人畜造成严重感染，是一种能引起食物传播疾病的动物和人的共患病原。葡萄球菌共有两种分型，分别为生物学分型和表型标记分型。金葡菌在葡萄球菌属中是一种重要的致病菌，金葡菌引起的感染主要是由于其含有血浆凝固酶。通过该病例的临床症状、解剖病理学改变及实验室病原菌的分离培养，确诊长颈鹿为金黄色葡萄球菌感染所致。因为这种菌株对β-内酰胺类和头孢类的药物有广泛的抗性，对氨基糖苷类的药物有中等的敏感，也有部分的耐药，因此，在治疗时，应尽可能的少用这两种药物。

金黄色葡萄球菌是一种非常常见的人类致病菌，可以引起皮肤、软组织的感染，以及致命性肺炎、骨髓炎、菌血症、心内膜炎等。另外，按照对抗生素药物敏感程度，金葡菌可分为耐甲氧西林金葡菌（MSSA）与耐甲氧西林金葡菌（MRSA）两种。近年来，随着细菌的进化，抗生素的滥用，金葡菌的耐药性一直在增强，全球范围内，MRSA感染率上升，MRSA 抗感染临床治疗难度加大。

本次野生动物园梅花鹿发生金黄色葡萄球菌感染，主要是该长颈鹿感染金黄色葡萄球菌。长颈鹿圈舍没有定期进行杀菌消毒，导致长颈鹿自身免疫力有所下降，同时又食入了环境中污染的金黄色葡萄球菌，在其体内从而导致发病。防制措施主要为立即将病死长颈鹿妥善处理，打扫圈舍卫生，采取相应应急措施采取及时，长颈鹿群中并未再发生病例。