9 株水貂铜绿假单胞菌的分离与鉴定

冷吉明，葛向平，刘长浩

（1.山东省胶州市里岔镇人民政府，山东 胶州 266300；2.山东省胶州市动物疫病预防控制中心，山东 胶州；3.齐鲁动物保健品有限公司，山东 济南）

水貂出血性肺炎是一种主要由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）感染而引起水貂以口鼻流血、急性死亡为主要特征的急性细菌传染病，是危害水貂养殖的重要疾病之一。该病在世界各地均有发生，我国是水貂养殖大国，由于养殖模式差异、管理水平差异、注射褪黑激素等原因，导致该病在我国呈现多年流行的情况。铜绿假单胞菌是引发水貂出血性肺炎的主要病原菌之一[1-4]，近年来也有报道其他病原菌引起水貂肺炎的病例。郭蕊、孙虎芝等报道了由肺炎克雷伯氏杆菌引起的水貂肺炎的病例[5-9]。于杰等报道了水貂出血性肺炎病例中存在铜绿假单胞菌与大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌等的混合感染[10]。但是铜绿假单胞菌仍然是造成水貂出血性肺炎，进而导致其死亡的主要病原。水貂的血清型众多，目前研究发现，水貂中常见的血清型以G型、B型为主，极少有其他血清型感染的报道。赵志腾、葛爱民等曾分别在水貂出血性肺炎病例中检测到C型、D型铜绿假单胞菌，但占比很低[11-12]，优势血清型仍然是G型、B型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例来源及背景 病例来源于山东、河北、辽宁、黑龙江等23 个发生肺炎死亡的养殖场，发病死亡水貂均已注射褪黑激素，皮张在9～10 月份成熟销售，其中8 个养殖场已经免疫出血性肺炎疫苗，15 个养殖场未免疫出血性肺炎疫苗。

1.1.2 试验试剂 铜绿假单胞菌血清型鉴别抗体购自北京易购安生物技术有限公司，产品为日本生研株式会社生产；营养琼脂、铜绿假单胞菌鉴别培养基、马丁琼脂和麦康凯琼脂培养基，均购自中海生物科技有限公司；药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；DNA Marker DL 2 000、2×Taq Master Mix，购自天根生化科技（北京）有限公司；pMD18-T 载体，购自TAKARA 公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 解剖病死水貂，无菌采取肺脏，划线接种于普通营养琼脂平板上，并将平板置于37 ℃ 恒温培养箱中培养14～18 h。

1.2.2 细菌分离与纯化 挑取单个典型菌落，在普通营养琼脂平板上做划线培养纯化，并挑取单个菌落接种于马丁琼脂、麦康凯琼脂及铜绿假单胞菌鉴别培养基平皿上，37 ℃ 培养14～24 h，取单个菌落进行16s RNA 鉴定。

1.2.3 PCR 鉴定及遗传进化树分析 挑取培养基上直径1～2 mm 单菌落，放入盛有100 μL 去离子水的1.5 mL 离心管内，沸水浴放置15 min。取出离心管并自然冷却至室温后，10 000 r/min离心5 min，取上清3 μL，用于细菌16s rRNA 的PCR 扩增。将扩增产物的测序结果与GenBank库进行BLAST 比对，鉴定细菌种属。16s rRNA引物（上游引物F：5’-GAGTTTGATCCTGGCT CAG-3’；下游引物R：5’-ACGGCTACCTTGTTA CGACT-3’）。PCR 反应体系见表1，PCR 扩增条件：95 ℃预变性4 min 后；按照94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s 循环，设置30 个循环，最终72 ℃ 延伸10 min 后4 ℃ 保温完成扩增，将扩增产物纯化后送生物公司测序，将测序结果与GenBank 中相关细菌进行比对。

表1 . 细菌16s rRNA 的PCR 反应体系

1.2.4 血清型鉴定 将1.2.3 所鉴定的9 株铜绿假单胞菌进行血清型鉴定，采用铜绿假单胞菌标准血清进行平板凝集试验。

1.2.5 细菌药敏试验 将经16s rRNA 鉴定的细菌，均匀涂布于普通营养琼脂平板，按照NCCLS 推荐的K-B 纸片扩散法进行抗生素药敏试验及结果判断。

2 结果

2.1 病原的分离纯化结果

从23 个养殖场水貂肺脏分离纯化出9 株细菌，细菌培养特性一致，在普通营养琼脂平板上长出圆形、扁平、边缘整齐的中等大小菌落，培养16 h 以上，菌落周边培养基被染成黄绿色（图1）。在铜绿假单胞菌选择培养基平板上，可长出相同形状大小的菌落，且整个菌落明显呈蓝绿色。12株细菌均为革兰氏阴性小杆菌，呈单个或成对排列，偶尔呈链状排列，染色形态一致（图2）。

图1 分离株在普通营养琼脂生长照片

图2 分离菌株革兰氏染色照片

2.2 PCR 鉴定及遗传进化树

针对9 株分离的疑似铜绿假单胞菌进行16s rRNA 扩增分析，扩增片段大小均约为1 500 bp（图3），扩增产物的测序结果为1 512 bp。经与GenBank 基因库中序列比对发现，9 株分离株的序列与编号 AJ549293.1的“ P. aeruginosa AT10”、编号Z76651.1 的“P. aeruginosa LMG 1242T”铜绿假单胞菌序列一致性为 99.1%～100%（图4），确定9 株分离株为铜绿假单胞菌。系统发育进化树发现，WF01、WD03、WD04、HY01、LN01、LN03、LN04、HB01、HB02 与P. aeruginosaAT10（ 编 号 ：AJ549293.1）、P. aeruginosa LMG 1242T（编号：Z76651.1）为同一分支（图5），证实这9株分离株均为铜绿假单胞菌。

图3 分离株16s rDNA 鉴定结果

图4 WF01、WD03、WD04、HY01、LN01、LN03、LN04、HB01、HB02 16s rDNA 同源性分析

图5 分离株WF01、WD03、WD04、HY01、LN01、LN03、LN04、HB01、HB02 16s rDNA 基因序列遗传进化树分析

2.3 血清型鉴定

将2.1 所鉴定的9 株疑似铜绿假单胞菌进行血清型鉴定，采用铜绿假单胞菌标准血清经平板凝集试验（图6）鉴定，结果显示，9 株细菌分离株中7 株为血清型G型，2 株为血清型B型（表2）。

图6 分离株平板凝集试验

表2 9 株铜绿假单胞菌血清型鉴定结果

3 讨论

水貂是我国特种养殖中重要的动物种类之一，多年来由于国内中小养殖场的养殖模式，在环境控制、饲料营养搭配等方面仍然存在一定不足，同时为了通过提前取皮，降低养殖成本，注射褪黑激素使水貂提前换毛，造成水貂出血性肺炎发病的加剧。山东及河北等地7 月初出现发病情况，而且发病持续期长达3 个月以上，这给本病的防控带来较大挑战。本研究中的15 个未免疫出血性肺炎疫苗的养殖场，肺炎发病率在5%～10%，病貂死亡率平均为41.6%，其中8 个养殖场病死貂中均分离到了铜绿假单胞菌；8 个免疫出血性肺炎疫苗的养殖场，肺炎发病率在0.5%～3%，病貂死亡率平均为28.5%，其中仅有1 个养殖场的病死貂中分离到铜绿假单胞菌，说明免疫出血性肺炎二价灭活疫苗能有效降低水貂死亡率。闫新武、赵志腾等曾分别报道，水貂免疫铜绿假单胞菌灭活疫苗对水貂出血性肺炎具有良好的免疫保护效果[13-14]。铜绿假单胞菌由于具有较强耐药性，在对山东、河北、辽宁等地临床调查发现，水貂养殖场分离的铜绿假单胞菌对临床常见的β-内酰胺类、氨基糖甙类、大环内酯类、喹诺酮类、四环素类等抗生素均呈现不同程度耐药性[15-17]，而且在肺炎发病高峰期，大剂量使用抗生素药物，也会造成药物中毒风险提高。有研究显示，个别地区的铜绿假单胞菌分离株对中药（五味子、乌梅）有较强敏感性，因此水貂养殖场在免疫出血性肺炎疫苗的同时，可选择配合部分中药制剂，进一步控制水貂出血性肺炎发病率，降低水貂死亡率，进而减少养殖场的经济损失。

4 结论

本研究从发生水貂肺炎养殖场的病死貂肺脏中分离到9 株细菌，经PCR 鉴定和遗传进化树分析确定是铜绿假单胞菌，表明水貂出血性肺炎的主要病原仍然是铜绿假单胞菌；9 株铜绿假单胞菌经平板凝集试验鉴定，其中7 株G型，2 株B型，表明目前造成水貂出血性肺炎的铜绿假单胞菌优势血清型仍然是G型和B型，与目前临床应用的水貂出血性肺炎二价灭活疫苗具有相同血清型。