一种过硫酸氢钾复合物粉的消毒效果评价

黄学林，何金艳，齐长喜，吴秋萍，刘建柱*，马保臣,2*

（1.江苏中牧倍康药业有限公司，江苏 泰州 225300；2.中国牧工商集团有限公司，北京；3.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安）

我国畜禽业的防疫工作始终贯彻“预防为主”的方针。消毒是畜禽业中非常重要的一项内容，是畜禽养殖业确保实现生物安全的前提[1]。目前，化学消毒剂是畜禽业使用比较多的一种消毒剂，主要分为醇类、酸碱类、氧化剂类、卤素类、醛类、酚类、表面活性剂类[2]，这类消毒剂刺激性较大、腐蚀性较强。

过硫酸氢钾复合物粉是一种具有消毒效率高、使用范围广、安全且无毒等特性的复方消毒剂，已经越来越多地被应用到畜禽养殖业[3]。过硫酸氢钾复合物粉的作用原理是：溶于水后由链式反应释放出活性氧进而形成羟基自由基、过氧化氢自由基等多种活性成分，使病原体蛋白质变性凝固，产生的羟基自由基可以破坏 DNA、RNA 的磷酸二酯键，使病原体DNA 和RNA 的合成受到阻碍，从而起到消毒杀菌作用[4,5]。

本试验使用的过硫酸氢钾复合物粉为粉红色颗粒状粉末，无刺激性气味，有效氯含量不低于10%。目前过硫酸氢钾复合物粉现行的质量标准，只规定了其相关的理化指标[6]，却没有能对禽养殖业的合理使用提供相关的理论依据和技术指导[7]。因此，本研究通过试验摸索出过硫酸氢钾复合物粉对常见病原菌和病毒的杀灭效果、最低有效杀菌和杀毒浓度以及现场消毒效果，为其在畜禽养殖中的科学使用提供一定的理论依据。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、毒株和细胞 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、摩根氏菌、沙门氏菌、链球菌、枯草芽孢杆菌、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、禽白血病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒Ⅱ型以及PK15 细胞，均由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 过硫酸氢钾复合物粉，有效氯含量不低于10%；营养肉汤培养基、LB 琼脂培养基，购自青岛高科技工业园海博生物有限公司；无菌脱纤维绵羊血、五水硫代硫酸钠、胰蛋白酶，购自索莱宝科技有限公司；琼脂糖凝胶粉末，购自科尚生物有限公司；50×TAE、DNA Marker（M116）、核酸染料，购自北京康润诚业生物科技有限公司；病毒DNA/RNA 提取试剂盒、Evo M-MLV Plus cDNA 合成试剂盒、ApexHFHS DNA 聚合酶-CL、DNA Marker（AG11904），购自山东赛恩斯科技有限公司；DMEM 细胞培养基，购自赛维尔科技有限公司；引物（表1）的设计与合成，均由生工生物工程上海（股份）有限公司完成。

表1 本文中用到的病毒基因的引物序列

1.2 方法

1.2.1 消毒液和中和剂的配制 细菌灭活试验借鉴兽用消毒剂鉴定技术规范（1992 年试行）[8]以及《GB15981-1995 消毒与灭菌效果的评价方法与标准》[9]。在超净台内，使用灭菌水将过硫酸氢钾复合物粉按1:200 的浓度配制消毒液；用灭菌生理盐水配制1%的硫代硫酸钠溶液作为中和剂[10]。将PK15 细胞在含有10%胎牛血清和抗生素（100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素）的DMEM 培养基中培养，并置于37 ℃ 含有5%CO2的培养箱中生长。

1.2.2 定量杀菌试验 将细菌悬液稀释至1.5×106CFU/mL。吸取0.5 mL 细菌悬液加入到无菌离心管中，再吸取4.5 mL 消毒液加入，混匀并计时，分别作用10、15、20、30 min，等达到反应时间，向离心管加入1%硫代硫酸钠进行中和。阳性对照组：用灭菌水代替消毒液，其它同试验组。中和10 min 后，吸取样品100 uL，分别接种至琼脂培养基平皿和血琼脂培养基平皿中，用无菌玻璃涂布棒将样品均匀地涂布在平皿上，在37 ℃ 培养箱中倒置培养24 h 后，进行菌落计数。杀菌率=（初始菌落数-消毒后菌落数）/初始菌落数×100%。

1.2.3 定性杀菌试验 采用二倍稀释法。在超净台内，取5 支无菌离心管并编号，每管加入营养肉汤培养基4.5 mL，再在第1 管中加入按要求配制的消毒液4.5 mL，涡旋混匀，然后吸取4.5 mL加入第2 号管，如此倍比稀释至第5 号管，第5号管中吸取4.5 mL 弃掉。消毒液浓度梯度为1:400 到1:6 400，然后按照1.2.2 中的方法将消毒液与细菌悬液处理后进行菌落计数。以无菌落生长的平板所对应的最小稀释度的浓度为该消毒剂的最低杀菌有效浓度。

1.2.4 现场消毒试验 分别选择墙壁、食槽、水槽、地面4 个位置，每个部位取3 个点作为取样点，用蘸有无菌1%硫代硫酸钠溶液的棉签在各个取样点上涂擦几下，并将棉签分别放入含10 mL 灭菌生理盐水的离心管中，室温浸泡30 min，作为对照。然后使用按要求配制的消毒液对墙壁、食槽、水槽、地面的取样点进行消毒。在消毒10、15、20、30 min 后，再分别对墙壁、食槽、水槽、地面4 个部位，每个部位取3个点取样，然后将棉签分别放入含10 mL 灭菌含有1%硫代硫酸钠生理盐水的离心管中，室温浸泡30 min，作为待测样品。然后按照1.2.2 中的方法对样品做接菌培养后进行菌落计数。现场消毒杀菌率=（消毒前菌落数-消毒后菌落数）/消毒前菌落数×100%。

1.2.5 定量杀毒试验 在超净台中，向无菌试管中加入消毒液 4.5 mL，置于 20 ℃ 恒温水浴5 min 后，加入0.5 mL 病毒悬液，立即混匀并计时，分别作用10、15、20、30 min。向各离心管加入中和剂（1%硫代硫酸钠），中和10 min。阳性（病毒）对照组：用灭菌水代替消毒液，其它同试验组相同。将试验组和阳性（病毒）对照组的待测样品分别接种于PK15 细胞，病毒液孵育2 h，然后使用PBS 对细胞进行3 次清洗，加入含2%胎牛血清的DMEM 培养基，最后将细胞培养板置于培养箱中（37 ℃，5% CO2）进行培养48 h。48 h 后将细胞反复冻融3 次，4000 r/min，离心10 min，取上清待测。按病毒DNA/RNA 提取试剂说明书提取上清液中的病毒核酸，进行常规PCR 检测，使用Іmage J 软件分析电泳条带灰度。杀毒率=（阳性对照组电泳条带灰度-试验组电泳条带灰度）÷阳性对照组电泳条带灰度×100%。

1.2.6 定性杀毒试验 按照1.2.3 中的方法对消毒液进行二倍稀释，然后将消毒液与病毒悬液处理后进行常规PCR 检测。以琼脂糖凝胶中没有电泳条带对应的最小稀释度的浓度为该消毒剂的最低杀毒有效浓度。

2 结果

2.1 定量杀菌结果

结果表明，过硫酸氢钾复合物粉在作用10 min 后，能够完全杀灭金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、摩根氏菌和沙门氏菌；对链球菌和枯草芽孢杆菌也有较好的杀伤效果，30 min 杀菌率分别为99.9%和99.1%，结果见表2。

表2 定量杀菌结果

2.2 最低杀菌有效浓度测定结果

根据2.1 中的结果，在最大消毒剂配制浓度（1:200）条件下，过硫酸氢钾复合物粉也不能完全杀灭链球菌和枯草芽孢杆菌，因此本试验对其他几种常见病原菌进行了最低杀菌有效浓度测定。结果表明，过硫酸氢钾复合物粉对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、摩根氏菌和沙门氏菌的最低杀菌有效浓度分别为1:3 200、1:3 200、1:800、1:1 600，结果见表3。

表3 最低杀菌有效浓度测定结果

2.3 现场消毒结果

结果表明，过硫酸氢钾复合物粉用于现场消毒10 min 后，对食槽、水槽、地面、墙面的细菌杀灭率在94%以上；消毒30 min 后，对食槽、水槽、地面、墙面等表面的细菌杀灭率达到99.9%以上，结果见表4。

表4 现场消毒结果

2.4 定量杀毒结果

由表5 可知，过硫酸氢钾复合物粉在作用10 min 后，对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和禽白血病病毒均能起到完全杀灭作用；对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒Ⅱ型杀灭效果较差。

表5 定量杀毒结果

2.5 最低杀毒有效浓度测定结果

根据2.4 的结果，在最大消毒剂配制浓度（1:200）下，过硫酸氢钾复合物粉也不能完全消杀猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒Ⅱ型，因此对其他几种病毒进行了最低杀毒有效浓度测定。结果表明，过硫酸氢钾复合物粉对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、禽白血病病毒最低杀菌有效浓度分别为1:1 600、1:3 200、1:3 200，结果见表6。

表6 最低杀毒有效浓度测定结果

3 讨论与结论

由于过硫酸氢钾复合物粉在配比上的差异，其消毒效果也存在差异[11-12]。因此，本文以某公司生产的过硫酸氢钾复合物粉为研究对象，评估了其对常见病原菌和病毒的杀灭效果，还对其现场消毒效果进行了评价。

结果表明，该过硫酸氢钾复合物粉对常见病原菌和病毒有很好的消毒效果，且对革兰氏阴性菌的杀灭效果比革兰氏阳性菌好，这与刘元元等[11]的结果相似。本研究发现该过硫酸氢钾复合物粉对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒Ⅱ型的消毒效果较差，可能与这两种病毒对含氯消毒剂不敏感导致。纪知刚[13]和Shirai 等[14]研究表明，大部分消毒剂灭不了猪圆环病毒Ⅱ型，而猪繁殖与呼吸综合征病毒更耐含氯消毒剂，这与本试验的研究结果一致。

本研究检测出的过硫酸氢钾复合物粉最低有效杀菌和杀毒浓度都比较低，并且该过硫酸氢钾复合物粉对食槽、水槽、地面、墙面表面的细菌有很好的消毒效果，这与刘元元等[10]的结果相似。较低的杀菌和杀毒浓度和较好的表面消毒效果有利于生产实践中成本的控制和大规模应用。

综上所述，该过硫酸氢钾复合物粉无刺鼻气味，具有良好的溶解性和稳定性，无论是对单种细菌或病毒，还是对饲养环境均具有较好的消毒作用。