抗PDL1-CAR慢病毒载体的构建及其转染培养体系的优化*

彭群艺，李纯团，郑艳，朱雄鹏

362000福建 泉州，福建医科大学附属泉州市第一医院 血液科

近年来，将嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）与T细胞结合的一种T细胞技术应用于肿瘤免疫治疗中已成为学术研究的主要焦点［1-2］。通过基因修饰使T细胞表达CAR，从而针对靶细胞进行直接识别和杀伤，这项技术在血液肿瘤治疗中取得了显著效果［3-5］。

CART细胞治疗常用的转染方法有三种：电穿孔、基于质粒的转座子/转座酶基因传递和慢病毒转染［6］。电穿孔法效率最差；基于质粒的转座子/转座酶基因传递法成本低，转染效率仅次于慢病毒法［7］；慢病毒转染效果最佳，但成本高［8］。

由于构建不同CAR载体，转染和培养方式的不同，以及细胞株等因素影响，导致每一次转染，转染效率差异较大，对CART细胞功能研究造成严重的影响。故本研究拟构建一种靶向程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PDL1）的CAR慢病毒载体（抗PDL1-CAR），并采用非磁珠法进行转染和扩增培养，并利用不同的病毒感染复数（multiplicity of infection， MOI）对T细胞进行转染，保证抗PDL1-CAR慢病毒转染效率，从而优化CART细胞最佳的转染条件与培养方式，为CART细胞的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人伯基特淋巴瘤CA46细胞株由福建省血液病研究所提供。本课题组在前期研究中，已将CD274基因慢病毒转导到CA46细胞中得以产生表达PD L1和mCherry荧光蛋白的PDL1-CA46细胞，并使用含有5 mg/mL嘌呤霉素的10%胎牛白清培养基培养。293T细胞（购自武汉普诺赛生命科技有限公司）为慢病毒的包装细胞，按5×105个/mL的细胞密度接种于10 cm的培养皿中，加入含10% 胎牛血清的DMEM培养基培养。

1.2 工具载体酶切

带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP） 的质粒GV401（购自上海吉凯基因科技有限公司）结构图见图1A，构建 50 μL酶切体系：ddH2O 43μL，CutSmart Buffer 2.5μL，质粒 DNA3μL，BamH I 1.5μL，混匀，37℃反应 3 h。反应后将产物电泳并回收目的条带。

图1 抗PDL1-CAR载体的设计与鉴定Figure 1.Design and Identification of the Anti-PDL1-CAR Vectors

1.3 获取与扩增抗PDL1-CAR基因片段

设计抗PDL1-CAR基因引物：上游5’-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTG-3’，下游3’-ATAAGCTTGATATCGAATTCTTAAACAACAGAGAAACGGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCG-5’。建立PCR体系：5×PS Buffer 10μL， 上下游引物（10μM）各1μL，dNTP Mix 4μL， Prime STAR HS DNA 聚合酶 0.5μL，抗PDL1-CAR基因（上海生工合成）样本1μL，ddH2O 32.5μL，共50μL。PCR循环条件：98℃加热5 min；98℃ 10 s、56℃ 10 s、72℃ 90 s，30个循环；72℃延伸8 min，4℃保温。PCR基因扩增产物进行凝胶电泳检测，110 V，电泳0.5 h。

1.4 抗PDL1-CAR基因PCR扩增产物与载体重组和转化

于冰浴中配制反应体系，样本组：ddH2O 3.5μL，5×CE II 缓冲液 2μL，酶切后载体DNA 2.5μL，抗PDL1-CAR基因PCR扩增产物 1μL，Exnase TM II 1μL，共10μL。GAPDH对照组：ddH2O 2.5μL，5×CE II缓冲液 2μL，酶切后的载体 DNA 2.5μL，GAPDH基因2μL，Exnase TM II 1μL，共10μL。混匀后37℃30 min，再冰浴 5 min 后立即转化。将 5μL转化产物与100 μL感受态混匀，冰上放置 30 min。 42℃热激 90 s，冰育 5 min。再加入 450 μL LB 培养基，37℃摇床振荡培养1 h。混合液均匀涂在平板上，倒置培养于37℃恒温培养箱中12～16 h。 转化后的样本送往上海生工进行测序，测序结果用基因比对软件DNA-MAN进行分析比对。最后将测序阳性的样本提取质粒。

1.5 转化子PCR产物鉴定

目的基因引物：上游5’-CCACCCAATGCTAATGAAG-3’，下游3’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-5’。建立反应体系：ddH2O 8.2μL，转化后阳性样本1μL，2× Taq Plus Master Mix 10μL，上下游引物（10 μM）各0.4μL，共20μL。PCR循环条件：95℃加热3 min，1个循环；95℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，32个循环；72℃延伸5 min，4℃保温。PCR扩增基因产物的凝胶电泳检测：制2%浓度的琼脂糖凝胶，取5μL的PCR产物，与1μL的EB混合后加入凝胶孔中，110 V，电泳0.5 h。

1.6 慢病毒的包装与浓缩

配制体系： pHelper 1.0质粒 15 μg，GV401质粒20 μg， pHelper 2.0 质粒10 μg，Lipo3000 22.5μL，用Opti-MEM将体积调整为 1 mL，加入293T细胞当中，培养6 h后更换含 10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃培养48 h。收集293T细胞的上清液，过滤后25 000 rpm 4℃离心2.5 h，弃上清，加入200 μL的DMEM培养基，于-80℃保存备用。慢病毒滴度检测由上海吉凯基因科技有限公司通过qPCR绝对定量法和荧光法检测完成，病毒滴度为2.07×105TU/µL。

1.7 抗PDL1-CAR细胞的转染与培养

采用非磁珠法，每次收集50～100 mL健康志愿者的外周血，并同时告知和签署科研知情同意书。通过连续密度梯度离心法从外周血中分离单个核细胞，在包被有抗CD3mAb和抗CD28mAb的6孔板中培养，加入IL-2（20 U/mL）。第2天， 取2 × 105个/孔的淋巴细胞于24孔培养板中，每孔体积为200 μL，按MOI= 10、20、40分别加入抗PDL1-CAR病毒载体10μL、20μL、40μL于24孔培养板中，IL-2（30 IU /mL），Histrnas P 10μL，transA 20μL。第4天， 去上清更换新鲜1640培养基，加IL-2（200 U/mL）。第8天，荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况，流式检测抗PDL1-CAR细胞的阳性率。并用Flowjo软件对数据结果进行分析。

1.8 细胞毒性试验

按MOI = 20的条件转染和培养效应细胞，每孔取5×104个表达mCherry荧光的PDL1-CA46于24孔板中，按1∶1、2∶1、5∶1和10∶1的效靶比加入相应的效应细胞（CART细胞和T细胞）进行混合共培养，每组重复3次。培养16 h后，先通过JIMBIO FIL检测细胞总数，再加入AnnexinV 5μL，流式检测仪检测0 h和16 h PDL1-CA46细胞百分率（Annexin V阴性mCherry阳性）。杀伤率% = （1-细胞总数×16 h PDL1-CA46细胞百分率/细胞总数×0 h PDL1-CA46细胞百分率）100%。

1.9 统计学方法

使用SPSS 17.0软件分析两独立样本均数，采用 MannWhitney U检验比较两组间差异，P ＜ 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 抗PDL1-CAR载体的构建

GV401载体经酶切后电泳显示PCR产物分子量约为10kb（图1B）。抗PDL1-CAR目的基因片段经电泳后显示条带的分子量为1.5 kb（图1C）。与线性表达载体进行重组和转化后，含有目的基因片段的转化子PCR产物大小为1 kb（图1D），构建出的慢病毒载体经上海生工基因测序比对，与MEDI4736序列一致。

2.2 抗PDL1-CAR载体的结构

抗PDL1-CAR载体结构的胞外段是信号肽和抗PD-L1 单链抗体可变区片段，单链抗体可变区片段可结合肿瘤细胞表达的PD-L1，该片段是源自于MEDI4736的重链可变区VH和轻链可变区VL序列，跨膜区序列是CD8铰链，胞内段由4-1BB和CD3ζ信号区组成，EGFP连接于信号区末端（图2A、2B）。构建的抗PDL1-CAR载体转染293T细胞72 h后，在荧光显微镜下可以观察到表达绿色荧光的细胞（图2C）。

图2 抗PDL1-CAR的构建与表达Figure 2.Construction and Expression of Anti-PDL1-CAR

2.3 抗PDL1-CAR细胞的表达

淋巴细胞在活化后按MOI = 10、 20、 40的条件加入抗PDL1-CAR病毒，培养第8天进行流式检测，各组CART细胞阳性表达率分别为28.80%±0.46%、54.77%±0.32%、71.37%±0.42%（图3A、B）。通过荧光显微镜检测，可观察到表达出绿色荧光的CART细胞（图3C）。

图3 抗PDL1-CAR不同MOI下的转染效率Figure 3.Efficiency of Anti-PDL1-CART Cells with Different MOI

2.4 抗PDL1-CAR细胞杀伤性检测

将PDL1-CA46肿瘤细胞按不同的效靶比与效应细胞共培养16 h，在1∶1效靶比时，CART细胞和T细胞两者对PDL1-CA46细胞杀伤率差异无统计学意义（Z = -0.218， P = 0.827）。在2∶1、5∶1和10∶1效靶比时，CART 细胞对PDL1-CA46细胞杀伤率显著高于T细胞，差异具有统计学意义（Z = -1.964， P ＜ 0.05），且效靶比越高杀伤活性越强（图4A），残留的PDL1-CA46细胞越少（图4B）。

图4 抗PDL1-CART细胞的体外杀伤检测Figure 4.Cytotoxicity of Anti-PDL1-CART Cells in Vitro

3 讨 论

CART细胞利用胞外的嵌合受体与靶细胞结合，可以不受主要组织相容性复合体限制，直接激活T细胞，从而对靶细胞产生免疫应答［9-10］。尽管CART细胞治疗在临床上已取得了一定的突破，但是CART细胞的构建及其转染培养仍然是影响CART细胞免疫治疗的关键因素之一［11-13］。

本次研究构建了一种新的抗PDL1-CAR慢病毒载体，其主要结构由抗PDL1 scFv（胞外段）和胞内的信号区（4-1BB和CD3ζ）组成，信号区末端协同表达一个EGFP，以便于在流式细胞仪和荧光显微镜下监测抗PDL1-CAR慢病毒载体的转染情况［14-15］。

在慢病毒转录过程中，常常会由于构建的载体不同，实验条件的差异，每一次构建的慢病毒载体滴度不同和细胞株的差异等因素，导致每一次转染后CART细胞的表达率也不相同，从而对接下来的CART功能研究产生许多不利的影响［16］。本课题组通过qPCR技术检测抗PDL1-CAR慢病毒载体滴度，利用3种不同的MOI进行抗PDL1-CAR慢病毒载体的转染，通过流式和荧光显微镜检测转染后抗PDL1-CAR细胞的表达率分别为28.80%±0.46%、54.77%±0.32%、71.37%±0.42%，每组MOI样本都重复3次，重复误差很小，从图3结果可以看出MOI = 20或者40的转染效率大于30%，在越高的效靶比下，CART细胞对PDL1-CA46细胞杀伤性越高，完全满足后续CART细胞的功能研究，而且不用担心重复转染造成转染效率结果的差异性。

CART细胞只有体外扩增培养出足够数量的效应细胞，才有利于CART细胞功能研究和体内回输治疗，目前最常用的CART细胞体外培养方式是磁珠刺激培养，Davila等［17］在研究中采用CD3/CD28磁珠刺激培养CD19-CART细胞，转染效率达38.4%。通过加入CD3/CD28磁珠反复刺激培养可以将细胞体外培养超过60天，且扩增数量达到109～1011［18］。采用磁珠方法效果虽好，但磁珠和相应设备昂贵，成本高，操作复杂。非磁珠法CART细胞体外扩增培养往往是通过培养瓶中包被抗CD3和CD28抗体来刺激细胞，并加入细胞因子进行扩增培养，Gargett 等［19］研究发现，CD3/Retronectin/IL-2激活扩增的GD1-iCART细胞低于CD3/CD28/IL-7/IL-15和CD3/CD28/IL-2，培养10～14天后细胞数量可扩增至106～107。本次研究采用非磁珠法对CART细胞进行扩增培养，并对此进行优化，培养出的抗PDL1-CAR细胞数量完全满足后续实验的需要，并且对表达PD-L1的血液肿瘤细胞CA46具有很强的杀伤性［20］。转染效率高，且成本相对磁珠法低，操作简单，但体外细胞培养观察中发现细胞活性持续时间不长，无法超过21天。

总之，本研究进一步探索了CART细胞的结构和功能，为CART细胞的构建提供良好参考，同时优化CART细胞的转染条件和培养方法，增加CART细胞的表达率和杀伤活性，为CART细胞的功能研究提供了基础。

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