宫颈癌组织中NHERF1、NF2蛋白表达水平及临床预后意义

周顾鑫 何月梅 陈小月 常方圆

江苏省东台市人民医院 224200

宫颈癌作为临床最常见的妇科恶性肿瘤,近年来发病已逐渐趋向于年轻化,数据显示,我国每年有新发病例13万,占世界宫颈癌新发病例的28%[1]。临床虽在宫颈癌治疗方面取得较大突破,但由于大多数患者确诊时已处于晚期,其复发、转移以及病死率仍较高[2]。因此,早期诊断宫颈癌对改善患者预后有着重要的意义。钠氢交换子调节因子1(Na+/H+exchanger regulating factor 1,NHERF1)是一种由358个氨基酸组成的多功能连接蛋白,既往研究发现在乳腺癌病情发展中发挥重要作用[3-4]。NF2是Ⅱ型神经纤维瘤病的关键基因,作为一种抑癌因子,在很多脑瘤中表达缺失,并且其编码Merlin蛋白功能的缺失是造成肿瘤发生、发展的重要因素[5-6]。目前NHERF1、NF2表达与宫颈癌的关系尚不清楚。因此,本研究拟分析宫颈癌组织中NHERF1、NF2蛋白表达水平及临床预后意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年7月—2017年7月经我院病理检查确诊的80例宫颈癌患者作为研究对象,年龄30～70岁,平均年龄(50.69±3.33)岁。收集80例宫颈癌癌组织标本及癌旁组织(距肿瘤边缘2cm处)标本。本研究已获我院医学伦理委员会批准。纳入标准:(1)符合宫颈癌诊断标准[7],并经术后病理检查已确诊;(2)知情同意;(3)术前未行放化疗治疗。排除标准:(1)伴有其他恶性肿瘤者;(2)重要脏器功能障碍者;(3)术前接受放疗、化疗及生物治疗者;(4)精神病史或存在语言、认知功能障碍者;(5)临床、随访资料不全者;(6)无法完全配合治疗者。本研究所有患者以术后出院为观察点,采用电话、门诊复诊或者上门等及结合复诊病历等方式随访5年,随访截至2022年7月30日或患者死亡。

1.2 方法

1.2.1 NHERF1、NF2表达检测方法。本研究所有组织标本均经石蜡、包埋、4μm连续切片、脱蜡,再用梯度酒精脱去苯至水以及苏木素染色后确定病变区域,随后采用柠檬酸修复液高温高压修复抗原,冷却后经PBS漂洗3次(3min/次),再加入按比例稀释的一抗(NHERF1鼠抗人单克隆抗体,购自美国Santa Cruz生物技术公司)4℃孵育过夜,PBS漂洗3次(3min/次),加入按比例稀释的二抗(NF2鼠抗人单克隆抗体,购自美国Santa Cruz生物技术公司)37℃孵育30min,PBS漂洗3次(3min/次),使用DAB显色、苏木素复染、树脂胶封片,镜下观察染色情况。一切操作均严格按照SP试剂盒说明书进行。

1.2.2 结果判定[8]。免疫结果由两位高年资的病理医师共同采用双盲法完成。随机选取5个高倍镜视野(×400),每个视野读取细胞计数100个细胞,最终根据细胞染色强度与阳性细胞百分比进行综合评分。阳性细胞染色强度评分:无色为0分、浅黄色为1分、棕色为2分、深褐色为3分。阳性细胞占总细胞百分比:<25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、>75%为4分。最终得分为阳性细胞百分比和染色强度平均分乘积,≥3分为阳性表达,< 3分为阴性表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS23. 0软件进行统计分析,计数资料以率(%)表示,采用χ2检验;采用Kaplan-Meier法分析宫颈癌预后生存情况;采用单因素和多因素Cox模型分析影响宫颈癌患者预后的相关因素,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NHERF1、NF2在宫颈癌组织及癌旁组织中的表达情况 宫颈癌组织中的NHERF1、NF2阳性表达率分别低于癌旁组织NHERF1、NF2阳性表达率(P<0.05),见表1。

表1 NHERF1、NF2在宫颈癌组织及癌旁组织中的表达情况[n(%)]

2.2 NHERF1、NF2表达与宫颈癌临床病理特征的关系 NHERF1、NF2表达水平与宫颈癌患者的年龄、肿瘤直径、深层肌浸润均无明显关系(P>0.05);NHERF1、NF2表达水平与宫颈癌临床分期、分化程度、淋巴结转移存在显著关系(P<0.05),见表2。

表2 NHERF1、NF2表达与宫颈癌临床病理特征的关系

2.3 NHERF1、NF2表达与宫颈癌患者预后的关系 80例宫颈癌患者的5年生存率为43.75%(35/80)。NHERF1阳性、阴性宫颈癌患者的5年生存率分别为66.67%(18/27)、32.08%(17/53),二者差异有统计学意义(P<0.05);NF2阳性、阴性患者5年生存率分别为68.97%(20/29)、29.41%(15/51),二者差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 宫颈癌预后的单因素分析 单因素分析得出:不同临床分期、分化程度、淋巴转移、NHERF1及NF2表达的宫颈癌患者5年生存率差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 宫颈癌患者预后的单因素分析[n(%)]

2.5 宫颈癌预后的多因素Cox回归分析 多因素Cox回归分析得出:临床Ⅲ/Ⅳ期、低分化、淋巴转移、NHERF1阴性、NF2阴性均为宫颈癌患者预后的独立危险因素(P<0.05),见表4。

表4 宫颈癌预后的多因素Cox回归分析

3 讨论

宫颈癌作为发病率仅次于乳腺癌的常见的妇科恶性肿瘤,近年来受环境改变以及性传播疾病的影响,宫颈癌发病率不仅逐年升高,且逐渐趋向年轻化[9]。世界卫生组织报告,我国宫颈癌发病率为14.6/10万[10],每年宫颈癌新发病例为13万例,每年死亡病例为5.3万例[11]。虽然随着科技和医疗的进步可有效控制疾病进展,但晚期宫颈癌患者预后生存率仍不理想。因此,寻找影响宫颈癌患者病情进展和预后的相关因素并积极予以干预,是改善宫颈癌患者预后的关键。近年来随着对宫颈癌的深入研究发现,分子生物学在涉及宫颈癌发生、发展及转移等各个方面。而本研究主要是分析宫颈癌组织中NHERF1、NF2蛋白表达水平及与临床预后意义。

NHERF1即膜—细胞骨架结合磷酸化蛋白50(Ezrin-radixin-moesin binding phosphoprotein 50,EBP50),作为一种由358个氨基酸组成的多功能连接蛋白,可通过PDZ-1、PDZ-2和EB结构域与多种蛋白质结合[12]。NHERF1目前在肿瘤疾病中具有抗肿瘤或促肿瘤功能,有文献表明, 肝细胞癌细胞株标本中, EBP50表达明显升高[13]。但同时研究显示,乳腺癌组织中NHERF1表达量低于癌旁组织,并影响了乳腺癌的恶性表型[14],结肠癌组织EBP50蛋白表达下调,与结肠癌临床病理特征有一定关系[15]。本研究分析发现,宫颈癌组织中NHERF1阳性表达率明显低于癌旁组织,且NHERF1表达水平与宫颈癌临床分期、分化程度、淋巴结转移存在显著关系(P<0.05),说明NHERF1在宫颈癌组织中表达降低,且与疾病的发生、发展存在一定联系,与既往其他癌症中的表达结果类似。本研究预后分析显示,NHERF1阳性宫颈癌患者5年生存率高于阴性患者(P<0.05),提示NHERF1表达与宫颈癌预后密切相关。与肖雪兰[16]的研究结果(EBP50在透明细胞性肾细胞癌高表达患者的预后生存期明显长于低表达患者)相符。多因素分析发现,NHERF1阴性表达是宫颈癌患者预后的独立危险因素(P<0.05),证实NHERF1在宫颈癌的发生、进展以及预后中有着重要的作用。NHERF1作为一种新发现的乳腺癌抑制基因,具有调控细胞周期、促进凋亡和抑制肿瘤等作用[17]。既往研究显示,NHERF1可能有助于调节其核积累的分子变化,抑制肾透明细胞癌细胞增殖[18]。因此,本研究宫颈癌患者NHERF1表达降低,说明其抑癌作用减弱,导致癌细胞增殖及侵袭能力增强,进而增加患者预后不良发生风险。

NF2作为肿瘤抑制基因,其编码蛋白-Merlin蛋白是ERM家族的成员之一,具有调控细胞增殖信号及导致肿瘤发生等作用。既往研究显示,NF2基因突变可导致其编码蛋白Merlin缺失,进而引起Ⅱ型神经纤维瘤病发生[19]。同时研究显示,肝癌细胞中恢复Merlin表达可减少TGF-β1的表达,抑制肝纤维化的发生[20]。本研究分析发现,宫颈癌组织中NF2阳性表达率明显低于癌旁组织,且与宫颈癌临床分期、分化程度、淋巴结转移存在显著关系(P<0.05),说明NF2低表达在肿瘤进展过程中具有推动和促进肿瘤进展以及更早发生转移的恶性作用。本研究结果显示,NF2阳性患者5年生存率高于阴性患者(P<0.05),说明NF2表达与宫颈癌预后密切相关。多因素分析显示,NF2阴性表达是宫颈癌患者预后的独立危险因素(P<0.05),证实NF2表达与宫颈癌发生、进展以及预后有关。NF2基因是一种肿瘤抑制基因,当其失活可诱导肿瘤发生。因此本研究宫颈癌患者NF2表达降低时,说明其抑癌作用减弱,导致患者病情加重,影响其预后。

综上所述,宫颈癌组织中NHERF1、NF2蛋白均呈低表达水平,且表达水平与临床病理特征及预后有关,有望作为临床评估宫颈癌预后的有效标志物。但本研究为单中心,更多研究结果需在今后进一步分析。