高效液相色谱法同时测定食品中的6 种人工合成色素

杨芩

（楚雄彝族自治州检验检测认证院，云南 楚雄 675000）

0 引言

市场上琳琅满目的加工食品中现在使用的色素主要分为两类，一类叫做天然色素，另一类叫做人工合成色素。天然色素被添加到食品中很安全的，但是在价格上又比较高，而且加工过程中也比较容易变色。但是颜色上来说，人工合成的比天然的鲜艳，也比天然的要稳定，着色力更加强，价格也比它低，所以人工合成色素被广泛应用于食品行业。人工合成的色素有着不同的化学结构，可以分为3 类：三苯甲烷、非偶氮类和偶氮类[1]。社会在发展，人们对人工色素合成过程及结构进一步了解，安全意识也在加强，国家对人工合成食用色素在食品中的添加进行严格的管控。可是因为它价格比较低而且性质稳定效果好，所以很多的人工合成食用色素超过国家限量标准，在市场上大量出现，严重危害人的健康，所以需要社会各个相关的部门加强对食品安全的监督和管理，进一步提高检验检测机构的能力，开发出一种更便捷、更快速、更准确的检测方法。

现在，国内和国外用于检测食品中的人工的合成色素的方法主要有电泳法、高效液相色谱法（HPLC）、离子色谱法（IC）、薄层色谱法（TLC）等。在国家标准《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中已经明确规定各种常见色素的在各类食品中的使用范围和它们的最大的使用限量，不同的色素可以添加在不同种类的食品中。以日落黄和柠檬黄为例，日落黄在饮料类的食品中的最大使用量是0.1g·kg-1，柠檬黄在糕点类、饼干中的最大使用量是0.05g·kg-1，日落黄与柠檬黄在糖果中的最大使用量是0.3g·kg-1[2]。还有很重要的一点就是在同一个食品中可能添加了不同的色素，它们不仅各自的使用不能超出国标规定的限汁，而且几种色素的最大使用量比例之和必须要小于1，除了国家标准中规定的色素以外，其他的那些色素都不能用于食品中。我们国家食品中的人工合成色素主要以高效液相色谱法（HPLC）作为检测方法。随着检验方法的不断改进，食品中的人工合成色素检测也变得更加精准起来了。HPLC 是一种现在最常用的合成色素检测方法，国内外的研究也比较多，检测的样品种类夜越来越丰富。从最开始的果蔬汁饮料里面的合成色素检测，到了后面的像蛋白饮料、肉类等含较多蛋白质的食品中合成色素的检测，HPLC 法对于食品中合成色素检测的准确性和精确性更高了。HPLC 法的原理是以高压下的也作为流动相，样品溶液通过色谱柱进行分离以后，再经过检测器对各种样品中的人工合成色素的种类和含量等进行检测，从而完成对该样品的检测分析，具有操作简便，选择性和准确性高，分离效果好的特点。

本文通过HPLC 法拟研究出一种能够同时检测出常见的6 种人工合成的色素的实验条件，建立一种能够同时检测食品中的合成色素柠檬黄、苋菜红、亮蓝、胭脂红、日落黄和诱惑红的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

LC-20A 型日本岛津的高效液相色谱仪（LC-solution型化学工作站、CBM-20A 型系统控制器、LC-20AB 型输液泵、SPD-M20A 型二极管阵列检测器、SIL-20AC 型自动进样器、CTO-20AC 型柱温箱）、梅特勒ME204E/02 型分析天平、HH-2 电热恒温水浴锅、KH19A 型离心机、SB25-12DT 型超声波清洗器、SYNS0000 型纯水机。

1.1.2 试剂

日落黄标准溶液（浓度均为0.500mg·mL-1，购自中国计量科学研究院）、柠檬黄标准溶液（浓度均为0.500mg·mL-1，购自中国计量科学研究院）、胭脂红标准溶液（浓度均为0.500mg·mL-1，购自中国计量科学研究院）、苋菜红标准溶液（浓度均为0.500mg·mL-1，购自中国计量科学研究院）、亮蓝标准溶液（浓度均为0.500mg·mL-1，购自中国计量科学研究院）、诱惑红标准溶液（浓度均为0.500mg·mL-1，购自中国计量科学研究院）。

甲醇（色谱纯，美国MREDA）、甲酸（色谱纯，美国MREDA）、无水乙醇（色谱纯，美国MREDA）；氨水（分析纯，重庆川东化工有限公司）、乙酸铵（分析纯，成都艾科达化学试剂有限公司）、柠檬酸（分析纯，重庆川东化工有限公司）。

试验用水均为超纯水一级，样品为市售饮料、糖果、配制酒等。

乙酸铵（0.02mol·L-1）溶液。称取1.54g 的乙酸铵，加水定容至1000ml 溶解，经微孔滤膜（0.45μm）过滤。

氨水溶液。用量筒量取氨水4～200mL 容量瓶，纯水定容至刻度后混匀。

甲醇-甲酸（6+4）混合溶液。用量筒量甲醇120mL，甲酸80mL，混合均匀。

柠檬酸溶液。称取20g 柠檬酸至小烧杯，溶解后转移到100mL 容量瓶，纯水定容至刻度后混匀。

氨水-无水乙醇-水溶液（2+7+1）。用量筒量取无水乙醇140mL、氨水40mL、纯水20mL，混合均匀。

1.2 样品处理

1.2.1 液体样品处理

称取20g（精确至0.0001g）至100mL 烧杯，超声驱除碳酸饮料中的二氧化碳，水浴加热驱除配制酒中的乙醇，乳饮料先离心沉淀，再加蛋白沉淀剂，用调pH 到6 左右（用柠檬酸溶液调）[3]。

1.2.2 固体样品处理

称取5g（精确至0.0001g）至100mL 烧杯，糖果、蜜饯等温水溶解后用柠檬酸调pH 至6 左右，巧克力豆用水反复洗涤合并漂洗液[4-5]。含脂肪较多的样品，比如肉制品，粉碎混匀后先用石油醚将脂肪洗掉，再用乙醇-氨水混合液提取样品中的人工合成色素，最后调节pH至6 左右；糕点类食品的检测是用乙醇-氨水混合液提取的色素，并利用超声提取对样品进行处理20min，最后用甲醇多次洗涤合并提取液。

1.2.3 聚酰胺吸附法提取色谱

前面步骤处理的样品溶液调节pH 约6 左右（加柠檬酸溶液调），加热到60℃，加入1g 左右的聚酰胺粉调糊状，再用G3 漏斗抽滤，用pH 约4 的纯水（60℃）来洗涤5 次，接着用甲醇-甲酸溶液再来洗涤5 次，然后用纯水洗至中性，后用乙醇-氨水-水混合液解吸5 次，收集溶液之后调至中性（用乙酸溶液调），蒸至近干，加纯水定容到5mL。过微孔滤膜（0.45μm），备用。

1.3 色谱条件

流动相为0.02mol·L-1的乙酸铵和甲醇，梯度洗脱，柱温35℃，流速均为1.0mL·min-1，进样量为10μL，紫外检测的波长为254nm，ODS-C18 型色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），实验完成之后根据以紫外吸收谱图的峰保留时间定性，外标法峰面积定量。

1.4 标准曲线

用纯水将各标准储备液配制成不同浓度的混合标准工作液，其浓度分别为5.0μg·mL-1、10.0μg·mL-1、25.0μg·mL-1、35.0μg·mL-1、50.0μg·mL-1，进样体积为10μL，用各组分的标液浓度和峰面积做出标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的测定

分别取柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝浓度为25.0μg·mL-1的标液，在160～410nm 波长范围内扫描，结果显示6 种合成色素在254nm 波长处都有较强吸收，所以我们选择254nm 的检测波长。

2.2 流动相选择

本文选择甲醇和0.02mol·L-1乙酸铵溶液为流动相，梯度洗脱，25min 内柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝这几种合成色素组分已经完全分离，而且分离度较高。液相色谱条件中的梯度洗脱流动相变化如表1 所示。

表1 液相色谱条件中的梯度洗脱流动相变化

2.3 流动相pH 的选择

本实验选择了pH 为4、5、6、7、8 的五种流动相，结果表明流动相pH 为5 时分离效果较好，6 种色素峰分离度好，出峰顺序依次为：柠檬黄6.818min，苋菜红7.596min，胭脂红9.273min，日落黄10.360min，诱惑红11.541min，亮蓝13.320min，标样色谱图如图1 所示。

图1 6 种色素的标准谱图

2.4 标准曲线和线性关系

本实验是用6 种色素各个组分的质量浓度（μg/mL）为纵坐标，以对应的峰面积为横坐标进行线性回归做的标准曲线（图2）。本文实验中所得柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝组分的保留时间、线性范围、线性方程、相关系数如表2 所示。

图2 标准曲线

表2 回归曲线的基本参数

2.5 回收率及精密度

用未加色素的样品进行回收率实验，添加水平分别为5mg·kg-1，测定3 次，测定结果表明被测样品的加标回收率为92.8%～98.7%，相对标准偏差（RSD）为1.2%～1.8%，测定结果可靠。样品回收率和及精密度试验如表3 所示。

表3 样品回收率和精密度试验

3 结论

目前一些厂家在很多食品中都添加了各种各样的色素，这样做看上去就增强了人的食欲，让人想去购买品尝，所以色素经常被用到食品加工行业中。还有一些厂家因为产品的新鲜程度不够，为了不被发现，就会违规或者超量使用色素。如果我们经常食用这些过量色素的食物，身体就会有影响，甚至是致癌。

本实验研究用HPLC 法能够更加准确、更加快速地同时检测出食品中的6 种人工合成的色素，并且能够达到各个色素的组分最好分离效果的实验条件。具有图谱组分分离度好、灵敏度高以及重现性强的优点，在实际工作中实用价值较高，可用于食品中人工合成色素的测定。通过这种方法来检测或控制食品中人工合成色素的含量，从而才能更好地保证食品安全。