超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定空气中25种羰基化合物

李利荣，王洪乾，左 明，刘殿甲，王效国，张肇元

（天津市生态环境监测中心，天津 300191）

醛酮类羰基化合物（CCs）是形成空气中多种自由基、有机酸、臭氧、过氧酰基硝酸酯（PAN）和二次有机气溶胶（SOA）等污染物的重要前体物，是光化学烟雾的主要成分［1-3］。大多数CCs具有刺激性、免疫毒性和生殖毒性，其中甲醛和丙烯醛是可疑致癌物［2］。CCs在环境空气［4-7］、室内空气［8］、车内空气［9］、汽车尾气［10-11］及烹饪油烟［12］，甚至在降水［13］和颗粒物［14］中均有不同程度的检出。1990年，美国清洁空气法修正案（Clean Air Act Amendments，CAAA）中，将醛酮指定为危险空气污染物。我国《大气污染物综合排放标准》（GB 16297—1996）、《室内空气质量标准》（GB/T 18883—2002）和《居室空气中甲醛的卫生标准》（GB/T 1627—1995）中也明确规定了甲醛、乙醛和丙烯醛的浓度限值。

空气中CCs的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）［4-10，15］、气相色谱法（GC）［16-17］、气相色谱-质谱法（GC-MS）［18-19］和分光光度法（SP）［20］等。其中，SP在测定CCs目标物时，存在检测种类单一、干扰物难以消除的缺陷；GC和GC-MS适用于低分子脂肪族CCs的测定，对于高分子CCs，由于其衍生物沸点较高且在高温中稳定性差等原因，仍存在应用上的瓶颈；液相色谱法（LC）是目前最为常用的CCs检测方法，但在定性检测方面，存在“容易出现假阳性”的缺陷。液相色谱-质谱法（LC-MS或LC-MS-MS）不但克服了LC定性检测方面的缺陷，而且在定量检测方面也具有很高的准确性，大大提高了CCs的检测水平。

LC-MS采用的离子源主要为大气压化学电离源（APCI）［21］或电喷雾电离源（ESI）［22］。常用的MS主要有离子阱质谱（ITMS）和四极杆质谱（QMS）。SAKURAGAWA等［23-24］用APCI源LCITMS/MS分析了环境及不同场所空气中的CCs。CHI等［22，25］采用ESI源LC-MS/MS建立了大气中32种CCs的定量分析方法；与HPLC-UV相比，LCMS/MS可以达到更低的检测限和检测更多的化合物，ESI源的负离子模式无论是在方法重现性，还在检出限方面均优于UV。尽管ITMS和QMS在CCs定性和定量检测方面较LC优势明显，但在定性检测方面，由于一般只选择一个母离子和一对子离子进行检测，所以仍存在较大的假阳性可能，且难以对样品中的CCs进行筛查。

本工作针对现行空气中CCs类污染物缺少筛查方法以及筛查与定量分析同时进行的检测技术，基于HPLC-高分辨质谱联用技术（Q Exactive）高准确度、高通量的优势，建立了25种CCs的快速筛查数据库及定量分析方法，并将其应用于实际环境样品的筛查和定量分析，以满足对空气中CCs类污染物的筛查和检测，为环境安全监测、预警和执法提供技术支持。

1 实验部分

1.1 材料、试剂和仪器

25种醛酮-2，4-二硝基苯肼（DNPH）标准溶液：包括甲醛（FA）、乙醛（AA）、丙烯醛（ACR）、丙酮（AK）、糠醛（2-FA）、丙醛（PA）、巴豆醛/丁烯醛（CA）、丁酮（BK）、甲基丙烯醛（MA）、丁醛（BA）、苯甲醛（BZA）、异戊醛（IVA）、环己酮（CHK）、戊二醛（GA）、戊醛（VA）、对-甲基苯甲醛（p-TA）、间-甲基苯甲醛（m-TA）、邻-甲基苯甲醛（o-TA）、甲基异丁基酮（MIBK）、己醛（HEXA）、2，5-二甲基苯甲醛（DMBA）、庚醛（HEPA）、辛醛（OA）、壬醛（NA）和癸醛（DA），质量浓度均为15 mg/L，美国ChemTek公司。

乙酸铵水溶液：将77 mg乙酸铵溶入1 L的超纯水中。

DNPH：纯度为99.5%，百灵威公司；甲醇、乙腈：色谱纯，MERK公司；超纯水。

Ultimate 3000-Q Exactive Focus型超高效液相色谱-电喷雾电离源-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪（UHPLC-ESI-Q-Orbitrap MS），配备Thermo Accucore RP-MS色谱柱（100 mm×2.1 mm，粒径2.6 μm）：美国Thermo Fisher公司；N-EVAP111型氮吹仪：美国Organomation公司；Lab dancer S000型涡旋搅拌器：德国IKA公司；Milli-Q型超纯水系统：美国Millipore公司；Cleanert DNPH-Silica型醛酮气体采样管（200 mg/3 mL）及臭氧去除管（240 mg/3 mL）：天津艾杰尔-飞诺美公司；0.22 μm尼龙水相针式滤膜：美国Supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集和保存

在真空泵作用下，气体样品经除臭氧小柱去除臭氧后，用DNPH柱吸附，样品中CCs与DNPH发生衍生化反应。采样流量0.5 L/min，采样体积100 L。用密封帽将采样管管口封闭，放入密封袋中，低于4 ℃条件下避光保存，保存时间不超过7 d。

1.2.2 样品制备

用乙腈洗脱采样管，洗脱方向与采样时气流方向相反，将洗脱液收集于5 mL容量瓶中，用氮吹仪浓缩至少于0.5 mL（若存在未溶解的橘红色颗粒物，可用少量乙腈溶解，乙腈用量不大于0.5 mL），用乙腈定容至0.5 mL，再用纯水稀释定容至1.0 mL，混匀，经针头过滤器过滤，滤液收集于2 mL棕色样品瓶中，待测。

1.2.3 分析条件

1.2.3.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Accucore RP-MS和Agilent Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，粒径1.8 μm，美国Agilent公司）；柱温：40 ℃；流动相A：1 mmol/mol乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL。流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.2.3.2 质谱条件

1）离子源参数

离子化模式：加热ESI；扫描模式：负离子模式；毛细管温度：325 ℃；加热温度：350 ℃；鞘气：N2，流速 40 arb （arb为非国际单位，在QE系列质谱仪中，鞘气流速1 arb相当于0.13 L/min，辅助气流速1 arb相当于0.3 L/min）；辅助气：N2，流速 10 arb；喷雾电压：2.8 kV；透镜电压：60 V。

扫描模式：全扫描/自动触发采集二级离子模式（Full MS/dd-MS2）扫描，用于筛查、定性和定量；平行反应监测（paralle reaction monitoring，PRM）用于数据库建立。

Full MS参数：分辨率70 000，自动增益控制（AGC）目标1×106，最大离子注入时间（IT）100 ms，扫描范围质荷比（m/z）50～600。

dd-MS2参数：分辨率17 500，AGC目标2×105，最大IT 60 ms，动态排除时间8.0 s，碰撞池归一化碰撞能量（NCE）25、45和65，循环次数3，隔离窗口m/z1.0。

P R M 参数：分辨率3 5 0 0 0，A G C 目标2×105，最大IT 60 ms，NCE 25、45和65，隔离窗口m/z1.0。

1.2.3.3 软件分析

在回程的列车上，略感疲惫的王树林抚摸着辛娜的大腿，眼望着窗外稍纵即逝的树木，脑子里盘旋着一件事：如果辛娜是处女就完美了。

采用软件Trace Finder 3.3进行分析，具体筛查条件如下。

一级母离子精确相对分子质量参数：峰强度阈值10 000，信噪比阈值5.0，允许m/z偏差5.00×10-6，保留时间（RT）允许偏移时间30 s。

二级子离子参数：最少匹配数1，峰强度阈值5 000，允许m/z偏差5.00×10-6。

同位素模式参数：相似度阈值70%，允许m/z偏差5.00×10-6，允许强度偏差20%。

定量方法：基于目标分析物一级母离子的峰面积，采用外标法进行定量。

定量参数：允许质量偏差5.00×10-6，允许RT偏差±1.5 s。

定性离子峰阈值：最高离子峰面积的10%，只选择10个峰高最高的离子。

积分参数：平滑度8，面积噪音系数5，峰噪音系数10，基线窗40。

2 结果与讨论

2.1 基体效应的影响

分别以乙腈、80%（φ，下同）乙腈水溶液、50%乙腈水溶液和20%乙腈水溶液为溶剂，配制质量浓度均为150 μg/L的25种醛酮-DNPH混合标准溶液进行分析。图1为不同溶剂条件下丙酮和丙烯醛的提取离子流色谱图。由图1a和图1b可见：用乙腈和80%乙腈水溶液作溶剂时，对出峰在己醛前的化合物，峰形均有不同程度的前延，对RT相近的同分异构体分离较差，影响定性和定量分析。以50%乙腈水溶液（见图1c）和20%乙腈水溶液（见图1d）作溶剂时，均能获得良好的色谱峰形和分离度，表明乙腈含量不高于50%的水溶液均可满足检测要求，为了便于实际样品测定，后续研究中均采用50%乙腈水溶液作溶剂进行25种醛酮-DNPH混合标准溶液的配制。

图1 不同溶剂条件下丙酮和丙烯醛的提取离子流色谱图a 乙腈；b 80%乙腈水溶液；c 50%乙腈水溶液；d 20%乙腈水溶液

2.2 色谱条件优化

对质量浓度均为150 μg/L的25种醛酮-DNPH混合标准溶液进行分离测定，考察Thermo Accucore RP-MS和Agilent Eclipse Plus C18两款色谱柱对目标物的分离效果。结果表明：25种目标物中丙酮和丙烯醛，糠醛和丙醛，巴豆醛、丁酮和甲基丙烯醛，环己酮和异戊醛，出峰顺序在两根色谱柱上相反；除邻-甲基苯甲醛和间-甲基苯甲醛不能实现分离外，两种色谱柱在30 min之内均可获得良好的分离度和尖锐对称的色谱峰形，表明两种色谱柱均具有良好的柱效和检测灵敏度。

进一步考察两种色谱柱在使用6个月过程中对目标物的RT，发现：采用Thermo Accucore RP-MS色谱柱时，25种目标物的RT的相对标准偏差（RSD）均小于1.0%，表明该色谱柱具有优异的稳定性，后续研究将采用Thermo Accucore RP-MS色谱柱进行分析。图2为醛酮-DNPH混合标准溶液经该色谱柱分离后，用UHPLC-ESI-Q-Orbitrap MS法检测出的25种CCs的总离子流色谱图。

图2 醛酮-DNPH混合标准溶液中25种CCs的总离子流色谱图

2.3 质谱条件优化

2.3.1 离子源参数优化

在色谱柱的柱流量为0.3 mL/min的条件下，对喷雾电压、鞘气流速、辅助气流速、毛细管温度和辅助气加热温度等影响离子化过程的主要参数进行优化，结果见表2。

表2 离子源优化参数范围

图3为不同离子源参数对25种CCs平均信号响应值的影响。由图3可见：在喷雾电压为2.8 kV、鞘气流速为40 arb、辅助气流速为10 arb、毛细管温度为325 ℃和辅助气加热温度为350 ℃的条件下，25种CCs的平均信号响应值最高。

图3 不同离子源参数对25种CCs平均信号响应值的影响

2.3.2 碰撞能量优化

碰撞池的碰撞能量（CE）是对定性结果影响最大的参数。在负离子模式下，考察不同二级裂解NCE条件下25种CCs的母离子和子离子碎片的响应，结果见表3。本工作选择大部分目标物的［MH］-峰丰度响应最接近20%时的NCE作为最佳CE，此时，既能保证可见［M-H］-峰，又能保证［MH］-及其碎片离子不会被过度碎裂。通过对比［MH］-峰与碎片离子最高峰响应值之比，发现：甲醛和戊二醛在平均NCE为30时，有最佳的CE值；其他目标物在平均NCE为45时，接近最佳CE值。因此，甲醛和戊二醛的最佳NCE为30，其余目标物的最佳NCE为45。

表3 不同NCE条件下[M-H]-峰与碎片离子最高峰响应值之比

2.3.3 质谱分辨率优化

高分辨质谱最大的优势是通过高分辨率提取到准确的目标物m/z，消除样品中的基质干扰，提高选择性和灵敏度，减少假阳性，从而提高定性和定量检测的准确性。为了得到目标物的最佳仪器响应值，本实验在Full MS/dd-MS2模式下，对一级质谱和二级质谱的分辨率进行了优化，分别对比了一级和二级质谱在扫描分辨率为17 500，3 5000，70 000时目标物的色谱峰形和碎片离子。结果表明：当一级质谱分辨率为70 000时，信噪比最高，目标物与基质干扰物可实现基线分离，色谱峰形较好；二级质谱分辨率为17 500时，主要碎片离子不变而干扰离子最少。因此选择一级质谱分辨率70 000、二级质谱分辨率17 500为Full MS /dd-MS2模式的最佳分辨率。

2.4 靶标筛查数据库的建立及验证

在上述优化的最佳色谱和质谱条件下，对质量浓度均为150 μg/L的25种醛酮-DNPH混合标准溶液进行检测，获得目标物的RT、母离子和碎片离子理论m/z及离子化形式等信息。采用TraceFinder 3.3软件对碎片离子进行解析，以各目标物二级质谱图中子离子实测m/z与理论m/z偏差小于5×10-6、且相对丰度最高值位于前5位的离子作为确认离子。在此基础上，以目标物的RT、母离子理论m/z和实测m/z以及特征二级子离子的理论m/z，建立筛查数据库（见表4），用于环境介质中CCs的筛查和定量测定。由表4可见：25种目标物母离子的实测m/z与理论m/z的偏差均小于2×10-6，因此该数据库能够满足定性检测的需求。

表4 25种醛酮-DNPH的筛查数据库

2.5 方法评价

配制质量浓度分别为0.450，0.750，1.50，3.00，4.50，7.50，15.0，30.0，45.0，75.0，150，300 μg/L的系列25种醛酮-DNPH标准溶液，在最佳分析条件下，以目标物母离子的提取色谱峰面积（y）为纵坐标，以目标物的质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，结果见表5。由表5可见：甲醛（FA）、乙醛（AA）、糠醛（2-FA）、丙烯醛（ACR）、丙醛（PA）和丁醛（BA）在质量浓度为0.750～300 μg/L，丙酮（AK）和丁酮（BK）在质量浓度为1.50～300 μg/L，甲基丙烯醛（MA）、异戊醛（IVA）、戊醛（VA ）、2，5-二甲基苯甲醛（DMBA）、庚醛（HEPA）和间-甲基苯甲醛（m-TA）在质量浓度为0.450～300 μg/L，对-甲基苯甲醛（p-TA）在质量浓度为1.50～150 μg/L，巴豆醛/丁烯醛（CA）在质量浓度为0.750～150 μg/L，环己酮（CHK）在质量浓度为0.450～150 μg/L，己醛（HEXA）、苯甲醛（BZA）、甲基异丁基酮（MIBK）、辛醛（OA）、壬醛（NA）和癸醛（DA）在质量浓度为0.450～75.0 μg/L，邻-甲基苯甲醛（o-TA）在质量浓度为0.750～75.0 μg/L，戊二醛（GA）在质量浓度为1.50～75.0 μg/L内线性关系良好，R2均大于0.996。25种CCs在质量浓度为1.50～75.0 μg/L范围内线性良好。

表5 25种CCs的标准曲线、线性范围、相关系数和检出限

依据《环境监测分析方法标准制订技术导则》（HJ 168—2020）［26］，采用向空白醛酮采样管中加标的方式，测定7组加标模拟样品中目标物的含量并计算标准偏差和方法检出限，结果见表5。由表5可见，各目标物的方法检出限为1.1～3.8 ng/m3。

向6组空白醛酮采样管中分别加入25种醛酮-DNPH标准溶液，制成加标量分别为4.50 ng、75.0 ng和150 ng的模拟样品，25种目标物的平均回收率分别为80.8%～123.0%、95.2%～111.0%和90.7%～106.0%，RSD分别为3.3%～18.0%、2.8%～10.0%和2.6%～12.0%。综上，本工作所建立的检测方法具有线性好、检出限低、精密度和准确度高的优点，可满足CCs定量检测的需求。

2.6 实际样品分析

采用本文所建立的方法，对天津市区某采样点2020～2021年间所采集的5个空气样品进行检测。结果表明：5个样品中除戊二醛未检出外，其余24种CCs的RT与筛查普库中的RT一致；24种CCs的母离子m/z测定值与理论值与筛查普库中的相应母离子的m/z测定值与理论值相差均小于5×10-6；24种CCs的二级质谱的5个碎片离子与筛查谱库中相应化合物的离子碎片一致，由此可见，5个样品中均含有24种CCs。定量分析结果表明：24种CCs的平均质量浓度为6×10-6～4.45×10-3mg/m3；其中丙酮、甲醛、乙醛、壬醛和己醛的质量浓度大于1.00×10-3mg/m3；甲基苯甲醛、甲基丙烯醛、糠醛、丁烯醛和甲基异丁基酮的质量浓度低于1.00 ×10-5mg/m3。

3 结论

a）本工作采用超高效液相色谱-电喷雾电离源-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪，建立了快速定性筛查和定量分析空气品中25种CCs的方法。

b）采用Thermo Accucore RP-MS色谱柱、在ESI负离子模式下，以Full MS和dd-MS2扫描模式进行检测。结果表明：25种CCs在1.50～75.0 μg/L范围内线性良好（R2≥0.996），方法检出限为1.1～3.8 ng/m3，样品回收率为80.8%～123.0%，RSD为2.8%～18.0%（n=6）。

c）采用本工作所建立的方法对天津市环境空气样品进行检测，共筛查出24种CCs，其中丙酮、甲醛、乙醛、壬醛和己醛的质量浓度大于1.00 ×10-3mg/m3，甲基苯甲醛、甲基丙烯醛、糠醛、丁烯醛和甲基异丁基酮的质量浓度低于1.0×10-5mg/m3。该方法快速、准确、灵敏，适用于空气中多种CCs的快速筛查及定量测定。