绿茶抑菌成分提取工艺优化研究

殷一明　赵德刚　郑文佳

摘要：為了实现多指标筛选绿茶中抑菌成分，对其提取工艺进行了优化。以3个贵州特色茶树品种（黔茶1号、黔湄419、黔湄601）夏季的一芽三叶为原料，福鼎大白茶为对照，分别加工成绿茶，采用双层平板法比较抑菌活性，并测定各提取物活性成分的含量，以相关成分的含量为指标设计正交试验研究提取工艺。结果表明，4个茶树品种绿茶甲醇提取物与水提取物共8个样品均表现出一定的抑菌效果，其中黔茶1号绿茶醇提取物的抑菌效果最佳。相关性分析表明，与抑菌作用呈相关关系的成分有总酚、总黄酮、儿茶素类、EGCG、ECG和EC。以上述6种成分为指标，最佳的提取工艺条件为：浸提时间12 min，浸提温度70 ℃，料液质量体积比1∶25，甲醇体积分数75%。3次平行验证RSD值均在5%以内。综上所述，本研究优选出的甲醇提取工艺条件科学合理、简单可行，可为黔茶1号的进一步研究和生产抑菌产品提供理论依据。

关键词：绿茶；抑菌；提取工艺；优化

中图分类号：TS272.5                                           文献标识码：A                                          文章编号：1000－3150（2023）08-10-8

Optimization of the Extraction Process of

Antibacterial Ingredients in Green Tea

YIN Yiming1， ZHAO Degang1，2， ZHENG Wenjia3*

1. Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region， College of

Life Sciences/Institute of Agro-bioengineering， Guizhou University， Guiyang 550025， China;

2. Guizhou Plant Conservation Technology Application Engineering Research Center， Guizhou Academy of Agricultural Sciences，

Guiyang 550006， China; 3. Tea Research Institute， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 550009， China

Abstract： In order to achieve multi indicator screening of antibacterial components in green tea， the extraction process was optimized.  Three Guizhou characteristic tea cultivars （'Qiancha 1' 'Qianmei 419' 'Qianmei 601'） were used as raw materials in summer， with one bud and three leaves as raw materials. 'Fudingdabaicha' was used as the control. These materials were processed into green tea. The antibacterial activity of each extract was compared using the double-layer plate method. The contents of active ingredients in each extract were determined. An orthogonal experiment was designed to study the extraction process， with the contents of related components as the index. The results show that a total of 8 samples of methanol and water extracts from four tea cultivars （'Fudingdabaicha' 'Qiancha 1' 'Qianmei 419'  'Qianmei 601'） exhibited certain bacteriostatic effects. Among these samples， the methanol extract of 'Qiancha 1' green tea showed the best antibacterial effect. Correlation analysis reveals that the components related to antibacterial activities include total phenols， total flavonoids， catechins， EGCG， ECG， and EC. Based on the above six components as the index， the best extraction process conditions are extraction time of 12 minutes， extraction temperature at 70 ℃， material-liquid ratio of 1∶25， and methanol concentration of 75%. The relative standard deviation （RSD） values of three parallel verifications were within 5%. The methanol extraction conditions selected in this study are scientific， reasonable， simple and feasible， which can provide a theoretical basis for further research and production of bacteriostatic products using 'Qiancha 1' as raw material.

Keywords： green tea， antibacterial， extraction process， optimization

多酚类物质作为茶叶中重要的功能性成分，主要包括儿茶素类、黄酮类、花青素类和酚酸类等[1]，不仅具有抗癌[2]、抗血栓[3]、防治心血管疾病[4]、助消化[5]、抗菌[6]、抗氧化[7]等功能，還具有美容护肤[8]等保健功效。研究表明，茶叶对于多种细菌、霉菌具有广谱抗菌作用，且在六大茶类中，绿茶的抑菌效果最佳[9]，特别是其中富含的茶多酚类物质表现出很好的抗菌能力。目前临床上对于细菌感染多使用抗生素治疗[10]，然而像铜绿假单胞菌这类细菌由于具有多重耐药机制，常导致抗生素治疗的失败[11]。因此，开发新的抗菌药物和寻找天然具有抗菌作用的替代物是临床治疗的理想选择[12]。

在其他条件一致的情况下，夏茶含有更高的茶多酚、咖啡碱、儿茶素等成分[13-14]，这些成分正是茶提取物中的主要活性成分[15]。夏茶产量高，但是由于饮用口感不佳，销售价格不高，茶农不愿采摘，常常造成资源的浪费[16-17]。本试验基于夏茶的这一特点，从贵州特色茶树品种[18-19]中筛选抗菌效果好的品种，并针对抗菌成分进行多指标提取工艺研究，为利用夏茶开发抗菌药物或抑菌产品提供支持。

1  材料与方法

1.1  试验材料

试验品种为黔茶1号（QC1H）、黔湄601（QM601）和黔湄419（QM419）3个贵州特色茶树品种和福鼎大白茶（FD），于2022年5月31日下午采自贵州省遵义市湄潭县贵州省农业科学院茶叶研究所象山茶园，采摘标准均为一芽三叶。试验供试菌株：金黄色葡萄球菌CMCC 26003（Staphylococcus aureus）菌株、铜绿假单胞菌CMCC 10104（Pseudomonas aeruginosa）菌株和大肠杆菌CMCC 44102（Escherichia coli）菌株，购自南京乐诊生物技术有限公司。

1.2  试剂与仪器

1.2.1  试剂

营养琼脂培养基、营养肉汤培养基，上海博微生物科技有限公司；甲醇（分析纯）、无水乙醇（分析纯），富宇化工有限公司；咖啡碱标准品，成都曼思特生物科技有限公司；抗坏血酸，国药集团化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠，德国Biofroxx；乙腈（色谱级），湖北弗顿科学技术有限公司。

1.2.2  主要仪器与设备

ME203T/02电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；SPX-100-B-Z恒温培养箱，上海博远实业有限公司医疗设备厂；HHS-21-4恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SpectraMax ABS Plus酶标仪，美谷分子仪器有限公司；岛津LC-2030C Plus高效液相色谱仪，日本岛津株式会社；XBridge C18色谱柱，美国沃特世公司。

1.3  试验方法

1.3.1  制样方法

茶青采用滚筒杀青机210 ℃杀青，80 ℃烘干至恒重，制得绿茶样品经粉碎机粉碎后过40目筛，密封低温保存备用。

1.3.2  提取方法

参考陈峰等[20]的方法，取10 g茶叶样品用250 mL水或甲醇在70 ℃水浴锅中浸提10 min，4 ℃，3 800 r/min离心20 min，取上清液并用真空旋转蒸发仪35 ℃进行浓缩，浓缩后得到的浸膏用无水乙醇定容至100 mL，密封低温保存备用。

1.3.3  抑菌圈的测定

采用双层平板法，将菌液加入固体培养基中并调节菌体含量为1×105 CFU/mL，牛津杯打孔，待培养基凝固后取出牛津杯，在每个孔中注入100 μL茶叶提取物。将平板置于冰箱中过夜后于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，培养后测定并记录抑菌圈大小，用溶剂做空白对照，重复3次。

1.3.4  绿茶提取物成分检测

总酚、总黄酮含量按照苏州格锐思生物科技有限公司试剂盒进行测定；儿茶素组分含量按照《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》（GB/T 8313—2018）[21]进行测定；咖啡碱含量参照《茶 咖啡碱测定》（GB/T 8312—2013）进行测定。

1.3.5  提取工艺单因素试验

参考卢利平等[22]的方法稍作修改，设浸提时间（A）、浸提温度（B）、料液比（C）、甲醇体积分数（D）4个因素，各因素水平设定如下，每个水平3次重复。测定各处理总酚、总黄酮、儿茶素类、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表儿茶素（EC）的浸出量。

浸提时间（A）试验：提取温度70 ℃，甲醇体积分数70%，料液质量体积比1∶25，浸提时间设6、8、10、12、14 min 5个水平。

浸提温度（B）试验：甲醇体积分数70%，提取时间10 min，料液比1∶25，浸提温度设40、50、60、70、80 ℃ 5个水平。

料液比（C）试验：提取温度70 ℃，甲醇体积分数70%，提取时间10 min，料液比设1∶25、1∶50、1∶75、1∶100等4个水平。

甲醇体积分数（D）试验：提取温度70 ℃，提取时间10 min，料液比1∶25，甲醇体积分数设60%、70%、80%、90%、100% 5个水平。

1.3.6   提取工艺正交试验设计

在单因素试验的基础上，选取浸提时间、浸提温度、料液比和甲醇体积分数这4个因素的不同水平，采用L9（34）正交试验设计（表1），以总酚、总黄酮、儿茶素类、EGCG、ECG和EC的浸出量为指标，采用因子分析法计算各指标权重系数，并计算综合评分，筛选出最佳工艺方案。

1.4  数据分析

数据分析使用SPSS 26软件，数据处理、绘图使用Microsoft Excel软件。

2  结果与分析

2.1  抑菌圈测定结果

对抑菌圈的大小进行测量，结果如表2所示。在4个茶树品种中，黔茶1号提取物的抑菌效果最强；小叶种的黔茶1号和福鼎大白茶比大叶种的黔湄601和黔湄419对于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌效果更好；黔湄419抑菌效果在4个品种中最差。

2.2  绿茶提取物成分检测

对4个茶树品种2种溶剂共8个提取物样品的抗菌相关成分进行含量测定，结果如图1所示。总酚、总黄酮、儿茶素类、EGCG、ECG、EC的含量均为黔茶1号绿茶醇提取物最高，表没食酯儿茶素（EGC）、儿茶素（C）和咖啡碱（CAF）含量则是黔湄601绿茶醇提取物含量最高。根据相似相溶原理，分子结构的不同导致其在不同极性溶剂中的溶解度不同，其中多酚类成分主要溶解在中、高极性的溶剂中[23]。

对所测各成分含量与抑菌圈大小进行相关性分析，结果见表3。3种菌抑菌圈大小与儿茶素类和EGCG的含量均表现出极显著相关，与总酚、总黄酮和ECG的含量表现为极显著相关或显著相关，只有大肠杆菌抑菌圈大小与EC含量表现出显著相关，其他成分则相关关系不显著。因此在后续试验中选择总酚、总黄酮、儿茶素类、EGCG、ECG和EC作为黔茶1号醇提工艺研究的指标成分。

2.3  提取工艺单因素试验

2.3.1  浸提时间对提取工艺的影响

如图2-A所示，在6～12 min内，随着提取时间的延长，总酚、儿茶素类、总黄酮、EGCG和ECG提取量呈上升趋势，当提取时间为12 min时，成分含量达到最大，分别为253.79、197.67、75.75、85.91、35.53 mg/g；12 min后提取量开始逐渐下降。EC提取量在6～14 min之间则呈现逐渐增加的趋势，最大提取量为15.42 mg/g。综合考虑各成分含量与相关性程度，后续选择浸提时间11、12、13 min进行正交试验设计。

2.3.2  浸提温度对提取工艺的影响

如图2-B所示，在40～70 ℃之间，总酚、儿茶素类、总黄酮、EGCG、ECG和EC浸提量呈逐渐上升的趋势，当提取温度为70 ℃时，各成分含量达到最大，分别为240.70、191.88、62.00、83.39、34.58、13.61 mg/g；继续升高提取温度至80 ℃各成分含量开始逐渐降低。因此后续选择浸 提温度65、70、75 ℃进行正交试验设计。

2.3.3  料液比对提取工艺的影响

如图2-C所示，在料液比为1∶25～1∶100之间，随着溶剂的增加，EGCG、ECG和EC的浸提量呈逐渐减少的趋势；总酚、总黄酮和儿茶素类成分的浸出量呈先减后增的趋势，且料液比1∶25与1∶100处理成分提取量差异不显著，因此综合考虑溶剂使用量与成本，选择料液比1∶20、1∶25、1∶30进行正交试验设计。

2.3.4  甲醇体积分数对提取工艺的影响

如图2-D所示，甲醇体积分数在60%～70%之间时，随着体积分数的升高，总酚、儿茶素类、总黄酮、EGCG、ECG和EC的浸出量上升，在70%时达到最大值，分别为240.70、191.88、62.00、83.39、34.58、13.61 mg/g。继续升高甲醇体积分数，各成分提取量开始降低，因此后续选择甲醇体积分数65%、70%、75%进行正交试验设计。

2.4  正交试验设计与结果

采用正交试验优选黔茶1号醇提工艺，以提取物中总酚、总黄酮、儿茶素类、EGCG、ECG和EC成分的含量为指标，以浸提时间、浸提温度、料液比和甲醇体积分数为考察因素，设计L9（34）正交试验进行工艺研究。各指标评分权重根据因子分析法 计算分别为总酚占17%、总黄酮占17%、儿茶素类占17%、EGCG占15%、ECG占18%、EC占15%，综合评分（Y）=0.17（A－Amin）/（Amax－Amin）+0.17（B－Bmin）/（Bmax－Bmin）+0.17（C－Cmin）/（Cmax－Cmin）+0.15（D－Dmin）/（Dmax－Dmin）+0.18（E－Emin）/（Emax－Emin）+0.15（F－Fmin）/（Fmax－Fmin）。其中A為总酚含量，B为总黄酮含量，C为儿茶素类含量，D为EGCG含量，E为ECG含量，F为EC含量。正交试验和方差分析结果见表4和表5。从表中可知最佳工艺结果为A2B2C2D3，即提取时间12 min、提取温度70 ℃、料液比1∶25，甲醇体积分数75%。其中影响抗菌相关成分浸出量的因素主次为D＞A＞B＞C，即甲醇体积分数＞浸提时间＞浸提温度＞料液比，其中浸提时间与甲醇体积分数对醇提工艺的影响显著。

2.5  样品验证试验

为进一步验证工艺的可行性和合理性，以上述确定的最佳提取工艺条件，平行试验3次，检测结果见表6。在此工艺条件下，总酚、总黄酮、儿茶素类、EGCG、ECG和EC的浸出量分别为（260.69±3.28）、（63.54±1.60）、（233.99±1.73）、（100.20±2.85）、（46.27±1.24）、（28.32±0.81） mg/g。可见，醇提取物中的总酚、总黄酮、儿茶素、EGCG、ECG和EC的含量基本稳定且与正交试验数据基本吻合，RSD值均在5%以内，表明该优选工艺条件可行。

3  小结与讨论

茶叶中成分复杂多样，不同品种、不同加工方式往往使得茶叶中的各成分含量也会存在巨大差异[19]。目前相关研究多集中于EGCG成分功能的研究[20-22]，但茶叶的特定功能是多种成分相互影响、共同作用表现出来的综合效果，因此若以单一指标进行优选往往不能保证整体质量，对指标成分进行合理筛选才是提取工艺选择的关键[23]。前部分试验表明，黔茶1号对于金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抗菌效果均为最佳，且对于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌效果强于大肠杆菌。

总酚、总黄酮、儿茶素、EGCG、ECG和EC是绿茶提取物中具有抗菌功能的主要成分，因此本试验后续选择上述成分为指标，基于正交试验整体优选提取工艺。利用因子分析法对指标成分赋权并采用Hassan法对各指标进行归一化处理，使得结果客观科学，避免了主观因素对结果的干扰。本研究所试品种中黔茶1号醇提取物的抑菌效果最强，优选的抑菌成分醇提工艺为：浸提时间12 min、浸提温度70 ℃、料液比1∶25、甲醇体积分数75%。在相关研究中，陈峰等[20]所得到的茶多酚最佳提取工艺为：甲醇体积分数66%、提取温度70 ℃、浸提时间10 min、料液比1∶25，除提取时间要缩短2 min外，其余工艺条件与本研究所得结果一致。这可能是由于所选用的材料不同，而且选取的指标成分种类、数量也有所差异，分析方法也不相同所导致的。

本研究以贵州特色茶树品种绿茶提取物为研究材料，发现其中黔茶1号品种的抑菌效果最佳，并进一步发现提取物对所试菌种抑菌效果与其中的总酚、总黄酮、儿茶素类、EGCG、ECG与EC成分的含量相关。并对黔茶1号绿茶抗菌成分的甲醇提取工艺进行了研究，经验证合理可行，为黔茶1号的研究与推广提供支持，并为研究利用夏茶开发抗菌药物或抑菌产品开拓了思路。本研究的不足之处在于主要是针对目前相关研究中已证明有抗菌作用的成分进行了测定比较，然而目前茶叶中已分离出2 000多种化合物[24]，仍然有很大一部分未鉴定出结构，因此茶叶中可能还存在抗菌效果显著但含量不高的成分，值得进一步挖掘。

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基金项目：遵义市科技支撑类项目（遵市科合支撑NS〔2020〕25号）、贵州省人才办“贵州省特色植物种质资源利用与创新人才基地”（RCJD2018-14）

作者简介：殷一明，男，硕士研究生，主要从事生物技术与工程方面的研究。*通信作者，E-mail：wenjia_zheng@126.com