miR-1271-5p靶向F13A1基因对口腔鳞状细胞癌的调控作用

徐培 王佳 陶冶 张晨 夏岩

摘 要：目的：探讨miR-1271-5p靶向F13A1基因对口腔鳞状细胞癌增殖和凋亡的调控作用。方法：培养OSCC细胞系SCC154细胞和人正常口腔角质形成细胞NHOK，检测miR-1271-5p、F13A1的表达。将细胞分为mimics NC组、mimics miR-1271-5p组，MTT检测细胞增殖，流式检测细胞凋亡，RT-qPCR 和WB检测F13A1的表达。双荧光素酶报告验证miR-1271-5p与F13A1的靶向关系。将细胞分为mimics NC组、mimics miR-1271-5p组、mimics miR-1271-5p+OE-F13A1组，MTT检测细胞增殖，流式检测细胞凋亡。结果：与人正常口腔角质形成细胞NHOK比，OSCC细胞miR-1271-5p表达降低，F13A1表达升高。相比于mimics NC组，mimics miR-1271-5p组细胞活力降低，细胞凋亡率增加，F13A1表达显著降低（P<0.05），inhibitors miR-1271-5p组F13A1表达显著升高（P<0.05）。相对于mimics miR-1271-5p组，过表达F13A1逆转miR-1271-5p对OSCC的抗增殖和促凋亡作用（P<0.05）。结论：miR-1271-5p靶向F13A1基因抑制OSCC细胞增殖，促进细胞凋亡。

关键词：口腔鳞状细胞癌；miR-1271-5p；F13A1；增殖；凋亡

中图分类号：R739.8  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2023）07-0024-05

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔癌的主要类型，口腔癌90%由鳞状细胞癌构成[1，2]。microRNA已被广泛认为与癌细胞抵抗化疗干预的能力有关，研究发现microRNA与OSCC的发生发展紧密相关[3]。近年来对microRNA在OSCC中的作用逐渐被发现[4，5]。据报道，miR-1271-5p参与许多人类癌症的进展，如miR-1271-5p被证实在卵巢癌[6]、子宫内膜癌[7]、前列腺癌[8]、胃癌[9]等疾病发挥关键调控作用。如研究表明miR-1271-5p在卵巢癌中抑制肿瘤发生[10]。此外，龙健等[11]发现miR-1271-5p靶向负调控FSCN1的表达，miR-1271-5p通过对FSCN1的调控从而抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，有望成为肺癌的关键治疗靶点。

凝血因子13（Coagulation Factor XIII，F13）是一种异酶原四聚体，参与凝血、伤口愈合、血管生成、肿瘤生长和细胞凋亡等过程。研究表明F13A1可能与OSCC的转移有关[12]，血栓形成相关的基因F13A1编码因子的功能性DNA多态性与口腔鳞状细胞癌（OSCC）的风险增加相关[13]。miR-1271-5p在OSCC中的作用尚未明确，且miR-1271-5p对F13A1的作用也未见报道。生物信息学分析发现miR-1271-5p与F13A1具有潜在靶向关系，但miR-1271-5p是否通过靶向F13A1调控口腔鳞状细胞癌尚未可知。本研究将探讨miR-1271-5p靶向F13A1基因对口腔鳞状细胞癌的调控作用，旨在为发现新的口腔癌治疗方法提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

OSCC细胞系（Tca8113、SNU899、SCC154）和正常人类口腔角质形成细胞株（NHOK）购买于美国典型培养物保藏中心（ATCC， Rockville， Maryland， USA）；Eagle培養基、10%胎牛血清均购自美国Gibco公司；转染载体购自genchemhem（上海，中国）；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；TRIzol、MTT试剂盒购自赛默飞生物科技公司；双荧光素酶试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；一抗、二抗均购自Abcam公司；流式细胞仪（FACSCalibur）购自美国BD公司；qRT-PCR基因检测试剂盒（QPG-023）购自Takara；荧光定量PCR仪（ABI7500）购自上海派克生物。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染

OSCC细胞系Tca8113、SNU899、SCC154和正常人类口腔角质形成细胞（NHOK）在37°C的Dulbecco改良Eagle培养基中培养，添加10%胎牛血清，在5% CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞提前1天以3.0×105细胞/皿的密度播种到60mm的培养皿中培养24小时。分为mimics NC组、mimics miR-1271-5p组、inhibitors miR-1271-5p、mimics miR-1271-5p+OE-F13A1组，依照Lipofectamine 2000说明书进行细胞转染。

1.2.2 RT-qPCR检测SCC154中miR-1271-5p、F13A1 mRNA相对表达量

取复苏后的SCC154，加入1ml TRIzol提取RNA，根据cDNA逆转录试剂盒合成cDNA，依照Premix Ex TaqTMII试剂盒进行反应体系设置。参照ABI7500型定量PCR仪进行RT-qPCR反应，基因引物序列见表1。采用2-ΔΔCt方法进行数据分析。

1.2.3 MTT检测细胞增殖

取上述各组细胞，以1×103个/ml的密度接种于96孔板，每组3个重复。分别在不同时间段24h、48h、72h加入20μl的MTT溶液，细胞培养48小时后振荡混匀置于酶标仪，检测490nm处吸光度值，并计算细胞增殖率。

1.2.4 流式检测细胞凋亡

细胞浓度为1×106时，用75%乙醇固定细胞；用预冷PBS洗涤2次，悬浮在1×Annexin缓冲液中，加入5μl Annexin V-FITC以及15μL PI染液，室温下黑暗保存15分钟。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 Western免疫印迹实验检测蛋白表达

用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，用双二酚酸蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度。采用12% SDS PAGE分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜，用5%（w/v）脱脂奶粉室温封闭1小时。洗膜后，加入一抗孵育4℃过夜，TBST冲洗，加入二抗室温下孵育1小时。TBST冲洗后利用ECL试剂显色并拍照储存。Imagel J软件分析目的蛋白条带灰度值。

1.2.6 双荧光素酶验证miR-1271-5p和F13A1的靶向关系

StarBase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）预测miR-1271-5p和F13A1之间的结合位点，并利用双荧光素酶报告实验验证靶向关系。根据预测结果设计并合成野生型序列（WT-F13A1）和突变型序列（MT-F13A1），然后分别与mimics NC或mimics miR-1271-5p共转染到OSCC细胞中。同时将mimics NC、mimics miR-1271-5p、inhibitors miR-1271-5p共转染至OSCC细胞中。孵育48h后，根据双荧光素酶检测试剂盒说明书，检测荧光素酶活性。

1.2.7 统计分析

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，所有符合正态分布的定量数据均表示为x±s，两组间比较采用t检验，三组及以上组间数据分析采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OSCC细胞系中miR-1271-5p低表达，F13A1高表达

与正常细胞系NHOK相比，OSCC细胞系Tca8113、SNU899中miR-1271-5p表达水平明显增加（P<0.05），而SCC25的表达水平显著降低（P<0.05）。qRT-PCR和WB检测SCC25细胞中F13A1表达，与对照组相比，SCC25细胞中F13A1表达明显升高（P<0.05）。后续选择SCC154进行实验。

2.2 过表达miR-1271-5p抑制OSCC细胞增殖，促进细胞凋亡

与mimics NC组相比，mimics miR-1271-5p组细胞增殖活力显著降低，细胞凋亡显著增强（P<0.05）。

2.3 miR-1271-5p靶向负调控F13A1的表达

Starbase数据库预测到miR-1271-5p与F13A1之间存在直接结合位点。相对于共转染MT-F13A1与mimic-NC，共转染WT-F13A1与miR-1271-5p mimic时荧光素酶活性明显降低（P<0.05）。与mimic-NC组相比，mimics miR-1271-5p组F13A1表达被抑制（P<0.05），inhibitors miR-1271-5p组F13A1表达显著升高（P<0.05）。

2.4 过表达F13A1逆转miR-1271-5p对OSCC的抗增殖和促凋亡作用

与对照组相比，mimics miR-1271-5p显著抑制细胞增殖，促进细胞凋亡（P<0.05），mimics miR-1271-5p+OE-F13A1和对照组相比无统计学意义（P>0.05），表明F13A1可以逆转miR-1271-5p过表达对OSCC的抗增殖和促凋亡影响。

3 讨论

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部癌症中最常见的一种，在中南亚人群中发病率最高，近年来发病率持续上升，全球5年生存率保持在50%左右[14]。本研究检测了OSCC细胞系SCC154细胞和人正常口腔角质形成细胞NHOK中miR-1271-5p、F13A1的表达，并验证了miR-1271-5p與F13A1之间的靶向关系，发现过表达miR-1271-5p抑制OSCC细胞增殖，促进细胞凋亡，过表达F13A1逆转miR-1271-5p对OSCC的抗增殖和促凋亡作用。

凝血因子13（Coagulation Factor XIII，F13）是一种异酶原四聚体，也称纤维蛋白稳定因子，是转谷氨酞胺酶（TGases）家族其中一员[15]。FXIII-A基因（F13A1）在骨髓和间充质系细胞中表达，尤其是巨核细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞、计时细胞、成骨细胞和前脂肪细胞[16]。王淮等[17]利用生物信息学方法对F13A1的CpG岛、启动子及转录因子结合位点进行分析，发现F13A1存在多个启动子区域和转录因子结合位点，参与细胞内多种细胞成分组成。Li等[18]在血清外泌体（SE）中鉴定出F13A1的表达与阳性淋巴结数量显著相关，预测可以帮助OSCC转移的诊断。Vylliotis等[13]研究血栓形成相关的基因编码因子F13A1等的功能性DNA多态性，发现与OSCC的风险增加有关。研究证明F13A1可作为肺癌患者潜在的新的诊断和治疗靶点[19]。此外，有报道F13A1还可作为结直肠癌筛查的新生物标志物[20]。本研究证实F13A1在OSCC中高表达，且与miR-1271-5p表达呈负相关。双荧光素酶报告显示miR-1271-5p与F13A1具有直接靶向关系，过表达miR-1271-5p显示F13A1表达下降，表明miR-1271-5p可能靶向调节F13A1的表达。

miR-1271-5p近年来被发现在多种癌症调控中具有关键作用，Han等[21]研究表明miR-1271-5p通过调控下游靶基因TIAM1抑制卵巢癌细胞的增殖。根据Zhang等[22]研究，LncRNA ZFAS1/miR-12 71-5p/HK2通过调节细胞增殖和凋亡促进胶质瘤的发展。王勇等[23]研究表明miR-1271-5p通过干扰DOCK1基因明显抑制肾癌细胞增殖，促进凋亡，有望成为未来RCC治疗的分子靶标。为了研究miR-1271-5p在OSCC中的作用，本研究过表达miR-1271-5p后，OSCC细胞增殖能力下降，细胞凋亡增强。继续过表达F13A1后，逆转miR-1271-5p对OSCC的抗增殖和促凋亡作用。表明miR-1271-5p可以通过靶向负调节F13A1的表达进而抑制癌细胞的增殖，促进凋亡。这与龙健等[11]研究miR-1271-5p对肺癌细胞的作用结果一致。表明miR-1271-5p对口腔癌的调控具有关键作用。

综上所述，过表达miR-1271-5p具有抑制OSCC细胞增殖，促进细胞凋亡的作用。miR-1271-5p可以靶向负调节F13A1的表达，过表达F13A1逆转miR-1271-5p对OSCC的抗增殖和促凋亡作用。因此，我们推测miR-1271-5p通过靶向负调节F13A1的表达促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。但本实验仅涉及体外细胞实验，没有做近一步的动物实验，具有一定的局限性，有待深入的研究证实。

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