鲍曼不动杆菌基因点突变与耐药性及生物膜特征的相关性研究

李振?杨萍?殷瑜?陈代杰

摘要：目的 研究鲍曼不动杆菌基因组上3个基因ptkD569N，shlBR403H及iclRY49H分别与基因pmrAI13M双位点突变，对鲍曼不动杆菌的耐药性和生物膜形成的影响。方法 在突变菌株AT196011的基础上，通过同源重组，构建3株双突变菌株AT196012、AT196013和AT196014；通过生长曲线考察不同点突变对细菌生长的影响；采用微量肉汤稀释法测定突变菌株对多黏菌素的最低抑菌濃度；通过时间-杀菌曲线动态分析，比较各突变菌株对多黏菌素的耐药性差异；采用结晶紫染色法对生物膜进行半定量测定，并用CCK-8试剂对生物膜内活菌数进行相对定量测定。结果 对PCR产物进行电泳检测与测序表明三株双突变菌株构建成功。各突变菌株对多黏菌素的最低抑菌浓度和时间-杀菌曲线表明，相较于AT196011单突变菌株，双突变株AT196012和AT196014对多黏菌素的耐药性增强，而AT196013的耐药性无明显变化；在生物膜形成方面，3株双突变菌株的生物膜生成量显著高于AT196011单突变菌株；1/2 MIC浓度的多黏菌素对AT196013与AT196014双突变菌株生物膜形成的抑制作用显著低于AT196011单突变菌株，其生物膜内活菌量也显著多于AT196011单突变菌株。结论 基因ptkD569N、iclRY49H和基因pmrAI13M的双点突变，会增加鲍曼不动杆菌对多黏菌素的耐药性；基因ptkD569N，shlBR403H和iclRY49H和pmrAI13M的双点突变，会协同促进生物膜的形成，且shlBR403H和 iclRY49H的促进作用更强，相应双突变菌株对多黏菌素的耐受性更强。

关键词：鲍曼不动杆菌；基因点突变；耐药性；生物膜；多黏菌素

中图分类号：R978.1文献标志码：A

Correlation study between gene point mutation of Acinetobacter baumannii

and drug resistance and biofilm characteristics

Li Zhen， Yang Ping， Yin Yu， and Chen Dai-jie

（School of Pharmacy， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240）

Abstract    Objective To investigate the effects of three point mutations in three different genes （ptkD569N， shlBR403H and iclRY49H） on drug resistance and biofilm formation in Acinetobacter baumannii. Methods Homologous recombination was used to create three double mutant strains， AT196012， AT196013， and AT196014， based on the previously created mutant strain AT196011; growth curves were used to examine the effects of various point mutations on bacterial growth， and the micro-broth dilution method was used to estimate the mutant strains lowest inhibitory concentration for colistin; the differences in the resistance of each mutant strain to colistin were compared using dynamic analysis of the time-kill curve; the biofilms were semi-quantitatively quantified by crystal violet staining， and CCK-8 reagent was used to measure relative viable bacterial counts in the biofilms. Results Three double mutant strains were successfully created， according to the electrophoresis and sequencing results of the PCR products. The double mutant strains AT196012 and AT196014 had stronger drug resistance than the single mutant strain AT196011， with no discernible difference in resistance between AT196013 double mutant strain and AT196011 single mutant strain; In terms of biofilm formation， the three double mutant strains produced significantly more biofilm than the single mutant strain AT196011; the inhibitory effect of 1/2 MIC colistin on the formation of biofilm in the double mutant strains AT196013 and AT196014 was significantly lower than in the single mutant strain AT196011 and the amount of viable bacteria in the biofilm was significantly higher than that of AT196011 single mutant strain. Conclusions Genes ptkD569N and iclRY49H， and the gene pmrAI13M， have a synergistic effect in drug resistance; the gene ptkD569N， shlBR403H and iclRY49H， and the gene pmrAI13M， also have synergistic effects in promoting the formation of biofilms. shlBR403H and iclRY49H had stronger promoting effects， and the corresponding double mutant strains had stronger tolerance to colistin.

Key words     Acinetobacter baumannii; Gene point mutation; Resistance; Biofilm; Colistin

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种需氧的革兰阴性杆菌，是全球医院获得性感染的重要原因[1]。2017年，在WHO发布的首份急需新型抗生素的重点病原体清单中，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（carbapenem resistant Acinetobacter baumannii， CRAB）被列为迫切需求新型抗生素的病原体。引起鲍曼不动杆菌产生耐药性的机制有很多，包括产生抗生素灭活酶、激活外排泵、改变外膜通透性及形成生物膜等[2]。

细菌生物膜是细菌附着在生物或非生物表面，通过分泌胞外多聚物，将其自身进行包裹而形成的一种结构。生物膜细菌在生理方面与一般的浮游细菌不同，被生物膜包裹的细菌具有有限的代谢活性并受到细胞外基质的保护，使其对抗生素和宿主的先天免疫成分更具有抵抗性[3-4]。生物膜的形成受多个基因以及环境因素的影响，同时更多生物膜形成的机制还有待于进一步挖掘[4]。

前期经过多黏菌素诱导鲍曼不动杆菌ATCC19606获得了稳定耐药的突变株AT19607，其对多黏菌素的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration， MIC）比野生菌株提高了32倍，同时其生物膜的生成量也显著提高。经全基因组测序与分析后发现，与野生菌株相比，AT19607菌株在pmrAI13M、ptkD569N、 shlBR403H和iclRY49H 4个位点处发生了点突变。进一步分别构建此4个基因的单突变株，发现pmrAI13M的突变对耐药性起主要贡献，其单突变菌株AT196011对多黏菌素的MIC值较野生菌株提高了16倍，但生物膜的生成量与野生菌株并无显著性差异。因此，本文主要探究AT19607菌株中另外3个点突变，与pmrAI13M点突变，是否在耐药性以及生物膜的形成中，存在协同作用。本研究分别构建了AT196012、AT196013和AT196014 3株双突变菌株，研究了其余3个点突变在鲍曼不动杆菌耐药性及生物膜形成中的作用。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒来源

鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606购自ATCC菌株保藏中心，突变株AT19611及含鲍曼不动杆菌重组系统的RecAb质粒pAT04，点突变模板质粒pLC001，pLC002和pLC003等由本实验前期自行构建（表1）。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

T100热循环仪（Bio-Rad）；Gene Pulser Xcell? 电穿孔仪（Bio-Rad）；EPS-200数显式稳压稳流电泳仪及HE-220高通量水平电泳槽（上海天能）；全自动微生物生长曲线仪（OY Growth Curves）；隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；TECAN多功能酶标仪；HFsafe-1200LC系列生物安全柜（力康生物医疗科技控股有限公司）。

1.2.2 试剂

细菌培养材料主要购自英国Oxoid公司；卡那霉素（Kan），四环素（Tet）购自上海源叶生物有限公司；KOD FX酶购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；结晶紫购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒购自苏州新赛美生物科技有限公司；多黏菌素E由上海医药工业研究院冯军老师提供；琼脂糖购自生工生物工程（上海）有限公司，本研究所用的引物均由该公司合成（表2）。

1.3 实验方法

1.3.1 细菌培养

鲍曼不动杆菌野生菌株ATCC19606及各突变菌株的甘油保存管放置冰上，划线于新鲜的相应抗性或无抗LB平板上，37℃培养箱培养16 h。挑取单个菌落接种于相应抗性或无抗LB液体培养基，37℃，220 r/min震荡培养16 h。

1.3.2 基因敲除菌株的構建

以相应的定点诱变模板质粒pLC002，pLC003，pLC004为模板，以引物M13F和M13R为上下游引物PCR扩增含突变位点的基因片段，扩增结束后将PCR产物用胶回收试剂盒纯化回收之后氮吹浓缩，制成约5 μg的点突变电转片段，-20℃保存待后续实验使用。

将含重组蛋白的pAT04质粒电转（2.5 kV）入AT196011感受态细胞中，之后涂布在含四环素（15 ?g/mL）的LB固体培养基中，37℃静置过夜培养，挑取单菌落接种于含四环素（10 ?g/mL）的LB液体培养基试管中，37℃，220 r/min条件下过夜培养，以3%接种量转接于含50 mL LB液体培养基的摇瓶中，添加终浓度为1 mmol/L IPTG和10 ?g/mL四环素，37℃，220 r/min震荡培养至A600nm=0.8～1.0；5000 r/min离心10 min收集菌体，用预冷的10%无菌甘油或无菌水洗涤2次，最终添加200 ?L冰预冷10%无菌甘油或无菌水中悬菌体并分装到3支EP管中，每支EP管分装100 ?L感受态细胞。将之前制备好的点突变电转片段加入100 ?L感受态细胞中，利用2 mm电转杯电转，电压为2.5 kV，电击后立即添加900 ?L LB液体培养基，37℃，220 r/min复苏1 h，菌液全涂于含四环素（终浓度15 ?g/mL）与卡那霉素（终浓度为100 ?g/mL）的LB固体培养基平板，37℃培养至单菌落长出，挑取单菌落进行菌落PCR验证。

将菌落PCR验证阳性的点突变菌株PCR扩增含突变点的片段，送生工生物工程（上海）有限公司进行测序验证。

1.3.3 各菌株生长情况的测定

将过夜培养的各菌株以1：1000的稀释比例接种于LB液体培养基中并加入到全自动生长曲线仪配套孔板各个孔中，每个菌株做3个复孔平行；设置培养温度37℃，每1 h自动测定各个孔中A600值，绘制各菌株生长曲线，观察各突变菌株的生长情况。

1.3.4 最低抑菌浓度的测定

参照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）发布的微生物药敏实验检测方法测定最低抑菌浓度（MIC）。挑单菌落过夜孵育，第二天将菌液1：1000稀释至MH（Mueller Hinton） 培养基中，用于MIC的测定。在96 孔板各孔中分别加入100 μL MH 培养基，加入梯度稀释的多黏菌素，最后加入100 μL前面稀释好的菌液（多黏菌素最终浓度梯度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL）。放入恒温培养箱中培养16～18 h，观察细菌的生长情况，以澄清孔的最低浓度为MIC值。

1.3.5 多黏菌素对各突变菌株的时间-杀菌曲线

将过夜培养的每种突变菌株活化的菌液以1：1000的比例转接到2个新的2 mL LB液体培养基试管中，每种突变菌株的2个转接试管其中一个加入终浓度为8 μg/mL的多黏菌素，另一个试管不加任何药物作为阴性对照。之后将各个试管放入37℃，220 r/min摇床中使菌液与药物共同孵育，分别于加药后0、2、4、8、12、24 h 6个时间点进行取样，将每次取出的菌液进行10倍梯度的稀释，取适宜稀释倍数的稀释液5 ?L点在LB固体培养基平板上，每个稀释倍数做3个平行，待吹干之后将平板放入培养箱中恒温培养16～18 h，进行菌落计数，以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示，并将各个组别不同时间点的菌落数量绘制成曲线。

1.3.6 突变菌株生物膜含量测定

将过夜培养的菌液用无菌LB液体培养基，按照1：100比例进行稀释，获得菌悬液。取一个无菌96孔板，每孔加入180 μL稀释后的菌液，并置于37℃恒温培养箱培养24 h。培养结束后，吸出96孔板里的菌液并用200 μL无菌生理盐水洗涤3次，洗涤完成后将96孔板放入60℃烘箱中固定1 h，之后加入180 μL浓度为1%的结晶紫溶液染色15 min，染色结束后吸出结晶紫溶液，加入生理盐水洗涤3次，之后加入180 μL 95%乙醇溶解结晶紫，测定溶液在A570nm的值来标定生物膜含量。

1.3.7 多黏菌素对突变菌株的生物膜形成抑制及生物膜活菌量测定

将过夜培养的菌液用LB液体培养基，按照1：100比例进行稀释，获得菌悬液。取一无菌96孔板，每孔加入180 μL稀释后的菌液，再加入终浓度为1/2MIC的多黏菌素，并置于37℃恒温培养箱培养24 h。

（1）生物膜含量的测定    按照“1.3.6”的方法洗涤，固定，染色，洗脱之后，测定溶液在A570nm的值来标定药物作用下生物膜含量。根据如下公式计算各突变菌株在1/2MIC的多黏菌素作用下，与未加药物的对照组比较，其生物膜形成受到药物抑制的抑制率：

（2）生物膜活菌量测定    吸出96孔板里的浮游菌，并用200 μL无菌生理盐水洗涤3次，再加入170 μL无菌生理盐水和10μL的WST-8溶液，孵育1 h，测定A450的值用以表征生物膜内相对活菌量。

1.3.8 统计学方法

采用SPSS 22.0分析软件对本实验数据进行处理分析，每个实验重复3次，数据均以均数±标准差表示。两组之间的比较采用独立样本T检验，以P<0.05（*），P<0.01（**）和P<0.001（***）为显示有统计学意义。

2 结果

2.1 点突变菌株的构建及测序验证

将卡那霉素平板上长出来的单克隆菌落采用菌落PCR验证，ptkD569N，shlBR403H和iclRY49H点突变菌株的验证，分别采用p-F1/p-R1， S-F1/S-R1， i-F1/i-R1引物进行验证，阳性菌落的条带大小分别为3.6 kb，4.5 kb，3.1 kb，阴性菌落的条带大小分别为2.6 kb，2.5 kb，2.4 kb。各点突变菌株PCR相关引物及位点设计如图1所示。将ptkD569N，shlBR403H和iclRY49H点突变阳性菌落，分别设计引物p-F2/p-R2，S-F2/S-R2和i-F2/i-R2，对包含突变点的片段进行PCR扩增（图2），并送生工生物工程（上海）有限公司进行测序验证，测序结果显示阳性菌落确实突变成功（图3）。

2.2 点突变对菌株生长的影响

通过测定不同菌株的生长曲线确定基因点突变会对菌株生长产生一定的影响。如图4所示，各突变菌株的生长速度均低于野生菌株ATCC19606，而各突变菌株之间没有显著性差异。

2.3 各突变菌株对多黏菌素耐药性的测定

2.3.1 多黏菌素对各突变菌株最低抑菌浓度的测定

将多黏菌素对各突变菌株的MIC值进行测定，结果表明，AT196012和AT196014双突变菌株的MIC值是AT196011单突变菌株的2倍，说明基因ptkD569N 和iclRY49H与基因pmrAI13M的突变，在耐药性方面存在协同或叠加作用；而AT196013双突变菌株的MIC值与AT196011单突变菌株一致，说明基因shlBR403H与基因pmrAI13M，在耐药性方面无相关作用（表3）。

2.3.2 多黏菌素對各突变菌株的时间-杀菌曲线

为了进一步比较各突变菌株耐药性的差异，测定了多黏菌素对不同突变菌株的时间-杀菌曲线，结果发现，当在8 μg/mL多黏菌素作用下，AT196012和AT196014双突变菌株及AT19607菌株几乎没有受到多黏菌素影响，其生长情况与未加药物的阴性对照菌株的生长情况类似；而AT196013双突变菌株与AT196011单突变菌株的生长明显受到了多黏菌素的抑制，其在0～2 h菌落数出现了明显的下降，但是由于8 μg/mL的多黏菌素对其没有起到完全的抑制作用，2 h之后菌落数开始上升，最终在24 h时的菌落数仍然略低于另外3株加药的突变菌株。通过测定突变菌株的时间-杀菌曲线，进一步说明ptkD569N和iclRY49H点突变与pmrAI13M点突变，在耐药性方面存在协同或叠加作用。

2.4 不同基因雙突变对生物膜形成的影响

2.4.1 不同突变株生物膜量的差异比较

用半定量结晶紫染色法，对各突变菌株培养24 h时，所形成生物膜量进行比较。结果如图6所示。各双突变菌株的生物膜含量在24 h时，都显著高于AT196011单突变菌株。其中AT196013和AT196014菌株的生物膜含量，要高于AT196012菌株，并且AT19607菌株的生物膜含量最高。这表明在生物膜的形成方面，基因ptkD569N、shlBR403H和iclRY49H，与基因pmrAI13M都存在协同作用，导致鲍曼不动杆菌生物膜量的增加，而AT19607的生物膜形成可能是多个基因作用共同叠加的结果。

2.4.2 亚MIC条件下多黏菌素对各突变株生物膜形成的影响

为了研究多黏菌素是否会影响各突变菌株生物膜的形成，测定1/2MIC多黏菌素浓度下各突变株生物膜的形成情况。结果如图7所示，在药物作用下，AT196013和AT196014双突变菌株的生物膜形成抑制率显著低于AT196011单突变菌株，AT196012双突变菌株生物膜形成抑制率要略低于AT196011单突变菌株，但两者之间没有显著性差异，所有突变菌株中，多黏菌素对AT19607菌株的生物膜形成抑制率最低。

同时对1/2MIC浓度多黏菌素作用下不同突变菌株的生物膜活菌量进行了测定，如图8所示， AT196013和ATCC196014双突变菌株的生物膜活菌量显著高于AT196011单突变菌株，而AT196012菌株的活菌量略高于AT196011单突变菌株，但两者之间没有显著性差异，同时AT19607的生物膜活菌量最高，这进一步说明生物膜形成能力越强，生物膜菌对环境的耐受性也更强。

3 讨论

近年来，对抗生素产生耐药性的鲍曼不动杆菌已成为对全球公共卫生的严重威胁，并被视为需要紧急关注的首要任务之一，而生物膜的形成是鲍曼不动杆菌在临床上对抗生素产生耐受性的重要原因[5]。因此，对鲍曼不动杆菌的耐药性及生物膜形成和调控机制进行深入探索对研发治疗鲍曼不动杆菌感染的药物具有重要的意义。

在对各突变菌株耐药性分析中，本研究发现，ptkD569N和iclRY49H点突变可以协同pmrAI13M点突变增加鲍曼不动杆菌的耐药性。本研究显示，AT19607耐药性的增加虽然主要与已报道的pmrAI13M点突变上调脂质A的修饰相关[6]，但与ptkD569N和iclRY49H点突变也存在一定相关性。前期研究表明，AT196015菌株的耐药性略强于野生菌株ATCC19606，而AT196016菌株的耐药性与ATCC19606类似[6]，因此猜测ptkD569N点突变可能和pmrAI13M点突变具有叠加增强ATCC19606耐药性作用，而iclRY49H点突变可能需要在pmrAI13M 点突变基础上通过其他途径上调细菌耐药性。

当对各突变菌株生物膜含量进行研究时，结果发现，ptkD569N，shlBR403H和iclRY49H点突变，与pmrAI13M点突变都具有协同作用，可以促进鲍曼不动杆菌的生物膜量的增加。目前有文献表明，与ptk基因相关的荚膜多糖的产生，与生物膜的粘附与发展存在关联[7-10]；而IclR家族作为一种转录调控因子，有研究表明其可以通过调控细菌的群体感应系统，以促进生物膜的生成[11-12]。因此，猜测ptkD569N和iclRY49H点突变，协同 pmrAI13M点突变，能导致生物膜形成量的增加，这可能与荚膜多糖的形成和细菌的群体感应系统有关；而shlB基因与细菌溶血素蛋白的生成有关[13-14]，但目前尚无报道其与生物膜形成存在关联。有研究表明，生物膜形成与多种细菌的毒力因子有关[4]，因此关于shlB基因所调控的溶血素毒力因子与生物膜形成的关系仍然需要进一步研究。此外，本研究还发现，在药物作用下shlBR403H和iclRY49H点突变，与pmrAI13M点突变协同促进生物膜形成的能力更强，其生物膜内存在的活菌量也更多，进一步说明其对环境产生的耐受性也更强。由于AT19607菌株的几个点突变是在多黏菌素作用下突变产生的，是菌株对环境产生耐受性的表现，而几株点突变菌株在对多黏菌素的MIC方面没有较大的差异，因此，本研究认为另外3个点突变对菌株耐受性的贡献可能主要体现在促进菌株生物膜形成进而增加其对环境的耐受性方面。

综上所述，本研究深入讨论了相关基因点突变与鲍曼不动杆菌的耐药性，及生物膜形成的关系，为抗鲍曼不动杆菌药物的研究提供了新的方向。但是这3个基因点突变，与pmrA基因相互作用对鲍曼不动杆菌药物的敏感性及生物膜的调控的机制，仍然需要进一步探索。

参 考 文 献

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