NR2F2基因调控猪PK15细胞增殖和凋亡的研究

张万锋,赵天枝,李 娇,尤紫薇,杨 阳,蔡春波,高鹏飞,曹果清,郭晓红,李步高

(山西农业大学动物科学学院,太谷 030801)

细胞增殖是细胞重要的生命活动,也是机体生长、发育、繁殖和遗传的基础[1-3]。细胞增殖是一个复杂而有序的过程,主要受细胞周期因子和周期蛋白依赖激酶调控,这些基因由很多信号通路所调控,如Wnt信号通路、Notch信号通路、TGF-β信号通路,而这些通路又受到许多转录因子的调控[4-11]。

鸡卵清蛋白上游启动子转录因子2(COUP-TFII,也叫NR2F2)是核受体家族超家族成员,在1986年因直接结合于卵清蛋白的启动子区调节其转录被发现[12]。在脊椎动物中,鸡卵清蛋白上游启动子转录因子家族由3个成员组成,核受体亚家族2组F成员1(NR2F1)、NR2F2和核受体亚家族2组F成员6(NR2F6)。虽然它们在不同的染色体上,但氨基酸序列是高度同源的[13]。NR2F2基因在组织中广泛表达,在骨骼、肌肉、脂肪形成和代谢平衡中起重要调节作用[14-16]。NR2F2作为一种转录因子,通过多种机制调控下游靶基因的转录。NR2F2可以通过与DNA结合元件结合,直接或间接激活基因表达。NR2F2可以与Wnt家族成员10b(Wnt10b)启动子区域结合,抑制Wnt10b的表达[17]。NR2F2可以与CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPα)启动子结合,抑制C/EBPα的表达[18]。NR2F2可以与维甲酸X受体(RXR)的DNA结合位点竞争性结合[19]。NR2F2还作为一种转录抑制剂,可与RXR和甲状腺激素受体相互作用,抑制PPAR的表达[20]。此外,NR2F2还可以通过直接结合RXR的LBD结构域来抑制核受体的转录[21]。

为了确定NR2F2基因对细胞增殖的作用机制,Ma等[22]研究发现,在WJ-MSCs细胞中敲除NR2F2基因后导致CyclinD1和CDK4表达降低,细胞增殖减慢。Qin等[23]对敲除NR2F2基因的PC3细胞与正常细胞进行了转录组比较,通过基因富集发现,在NR2F2基因表达低时,TGF-β信号通路下游调控的基因全部富集,说明NR2F2能调控TGF-β信号通路。敲除NR2F2基因后,显著改变了TGF-β信号通路下游基因p21、p15和CyclinD1的表达。Wang等[24]研究发现,NR2F2基因在直肠癌细胞中与PTEN、Smad4基因的表达相关,而Smad4基因是TGF-β信号通路的关键基因。Smad4基因主要功能是参与TGF-β信号通路的信号传导。进一步研究发现,NR2F2蛋白能够与Smad4蛋白结合,与突变型的Smad4不能结合,直接证明了NR2F2与Smad4之间的结合作用。表明在癌细胞中,NR2F2基因可以通过与Smad4基因相互作用,进而影响TGF-β信号通路传导。

目前,围绕NR2F2基因的研究主要集中在其对人类癌症等疾病、小鼠肌肉与脂肪等组织的作用机理,针对NR2F2基因调控猪源细胞增殖的机制还未见报道。本试验旨在探究NR2F2基因对细胞增殖、凋亡的影响,为进一步研究猪生长发育的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系和质粒 本研究中使用的PK15细胞和293 T细胞来自山西农业大学动物遗传育种与繁殖博士点实验室。

pLenti-CMV-GFP-SV-puro、pLenti-CMV-NR2F2-GFP-SV-puro、pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G、pCDNA3.1-Flag、pCDNA3.1-Flag-NR2F2、pHS-CR054、pHS-CR054-sg1、pHS-CR054-sg2质粒均为山西农业大学动物遗传育种实验室保存。

1.1.2 主要试剂 PrimeScriptTMRT Master Mix、RNAiso Plus regent和SYBR Premix Ex Taq II购于TaKaRa公司;PBS粉末、青链霉素混合液、胰蛋白酶购于中国索莱宝公司;FBS和DMEM购自Gibco公司;兔二抗、鼠二抗购于LI-COR公司;Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司;CCK-8试剂盒购自Dojindo公司;EdU试剂盒、细胞周期试剂盒、细胞凋亡试剂盒购自凯基生物公司;RIPA裂解液(强)、蛋白酶抑制剂、蛋白凝胶试剂盒、NC膜、脱脂奶粉购自博士德公司;β-actin抗体购自博奥森公司;NR2F2抗体购自Abcam公司;PCNA抗体购自CST公司;siRNA购自吉玛公司,siRNA序列见表1。

表1 siRNA序列

1.2 试验方法

1.2.1 慢病毒包装及转染细胞 转染前1 d,胰酶消化293 T细胞,接种细胞于10 cm细胞培养皿,培养1 d,当细胞浓度达到60%～80%时进行转染。用Lipofectamine 3000将10 μg pLenti-CMV-GFP-SV-puro或pLenti-CMV-NR2F2-GFP-SV-puro质粒与7.5 μg pCMV-dR8.91、5 μg pCMV-VSV-G包装质粒共转染293 T细胞中,转染6 h后,更换为完全培养基,继续培养48、72 h后,收集293 T细胞培养液,4 ℃、1 000 r·min-1离心5 min,去除细胞碎片,0.45 μm针式滤器过滤,收集病毒液置于-80 ℃冰箱,用于感染PK15细胞。

将PK15细胞接种于6孔板中,待细胞汇合度达到50%～60%,每孔加入1 mL病毒上清液,感染6 h后,更换为完全培养基培养,感染72 h后,荧光显微后荧光显微镜检测EGFP的表达,形成稳定转染NR2F2基因的细胞。

1.2.2 质粒和siRNA转染 PK15细胞接种至10 cm培养皿中,使用含10%FBS和1%双抗的低糖DMEM培养基在37 ℃,5% CO2条件下进行培养。将细胞进行消化计数,接种至6孔板中,细胞生长汇合至40%～50%即可进行转染。利用Lipofectamine 3000脂质体分别将pHS-CR054、pHS-CR054-sg1、pHS-CR054-sg2质粒、siRNA-NC及siRNA-Smad4转染至PK15细胞中,每组3个重复。按转染试剂操作说明,取两个1.5 mL离心管,分别加入125 μL DMEM培养液,然后于其中一管加入100 pmol siRNA或4 μg质粒吹打混匀;另一管加入10 μL转染试剂吹打混匀,室温静置5 min后,将含有siRNA或质粒的培养液加入含转染试剂的培养液中吹打混匀,室温静置20 min。将制备好的转染溶液加至6孔板,并用DMEM加至每孔2 mL,于37 ℃,5% CO2中培养,6 h后更换为含10%胎牛血清的培养液。转染后观察结果并收取细胞进行后续试验。

1.2.3 RNA提取及实时荧光定量PCR 使用RNAiso Plus提取总RNA,提取方法参照试剂盒说明书。将提取的总RNA用核酸蛋白测定仪测定其纯度及浓度,OD260nm/OD280 nm为1.8～2.0的总RNA用于后续研究,采用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒将RNA反转录成cDNA。

以18 S rRNA为内参基因,采用qRT-PCR对基因的表达水平进行检测。qRT-PCR反应体系:cDNA 2 μL,2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL,上、下游引物(表2)各0.5 μL,RNAase Free ddH2O补至20 μL。反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,35个循环;熔解曲线程序为95 ℃ 15 s,60 ℃ 35 s,95 ℃。结果采用2-ΔΔCt法进行分析,每个样本做3次重复。

表2 qRT-PCR引物序列

1.2.4 总蛋白提取和Western blot检测 提取细胞总蛋白,利用核酸蛋白浓度测定仪测定蛋白浓度。取200 ng蛋白上样,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后,采用湿转法进行转膜,5%封闭蛋白粉室温封闭1 h,一抗采用1∶1 000稀释,4 ℃孵育过夜。隔天回收一抗,PBST洗膜3次,加入荧光二抗,避光室温孵育1 h,洗膜后使用LICOR仪器曝光,使用仪器自带软件Image Studio计算分析条带光密度值。

1.2.5 CCK-8、EdU试验 将细胞接种至96孔细胞板中,每孔细胞约1 000个,在铺板后0、1、2、3、4、5 d分别进行检测,检测前每孔加入10 μL的CCK-8试剂,在细胞培养箱孵育3 h后,使用酶标仪检测450 nm吸光度。

取处于对数生长期的细胞,以每孔4 000～10 000个细胞接种于96孔板中,每孔加入100 μL EdU染液和100 μL Hoechst33342溶液,染色完毕后使用荧光显微镜成像。

1.2.6 流式细胞术检测 将细胞接种至6 cm细胞培养皿,培养至细胞浓度80%～90%时,收集的细胞在70%冷乙醇中重悬,4 ℃固定过夜,复温后加入400 μL PI染色,4 ℃避光孵育30 min,流式细胞仪检测。

将细胞接种至6 cm细胞培养皿,培养至细胞浓度80%～90%时,PBS洗2次,收集细胞;加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞,加入5 μL Annexin V-APC混匀后,加入5 μL 7-AAD染液,混匀,室温、避光、孵育15 min;流式细胞仪检测。

1.2.7 伤口愈合试验 将细胞接种至6孔板中,待其长满后,用1 mL蓝枪头在六孔板内划线,PBS清洗2次,加培养基继续培养,观察0、12、24、36、48 h时划痕处细胞的生长状态。

1.2.8 CO-IP试验 收集转染了过表达NR2F2且携带Flag标签蛋白载体的PK15细胞,加入40 μL Flag树脂的裂解液在4 ℃下轻轻摇晃孵育过夜,然后用500 μL细胞裂解缓冲液漂洗树脂,混匀仪上室温漂洗5 min,4 ℃ 500 r·min-1离心5 min,重复3次,加入50 μL洗脱缓冲液,漩涡震荡20 s,放摇匀仪上,室温洗脱10～15 min,漩涡震荡20 s,4 ℃ 12 000 r·min-1离心5 min,取上清到新的离心管中,用于Western blot。

1.2.9 数据分析 应用SPSS 22.0进行统计分析。数据采用单因素方差分析和独立样本t检验进行比较,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结 果

2.1 慢病毒包装及NR2F2基因过表达效率

病毒液感染PK15细胞48 h后,荧光显微镜观察发现OE-NC组和OE组都表达了绿色荧光蛋白(图1A)。qRT-PCR和WB检测过表达NR2F2基因的效率,结果发现,慢病毒液感染PK15细胞后,NR2F2基因mRNA水平和蛋白水平极显著增加(P<0.01,图1B～D)。

A.绿色荧光蛋白EGFP表达(标尺为100 μm);B～D.过表达NR2F2基因mRNA和蛋白水平表达。“**”表示差异极显著(P<0.01),“*”表示差异显著(P<0.05)。下同

2.2 过表达NR2F2基因对细胞增殖、凋亡的影响

慢病毒感染PK15细胞后,结果显示Ki67基因mRNA表达极显著增加(P<0.01,图2A);qRT-PCR、WB检测结果显示,PCNA表达量显著增加(P<0.05,图2A、2B、2C)。CCK-8结果显示,过表达NR2F2基因后细胞的吸光度值随着时间的增加极显著上升(P<0.01),差异具有统计学意义,表明促进了细胞的增殖(图2D)。EdU结果显示,过表达NR2F2基因后S期细胞数量显著增多(P<0.01),表明促进了细胞的增殖(图2E、F)。流式细胞仪检测过表达NR2F2基因后细胞周期变化,发现过表达NR2F2基因后,处于G1期细胞的数量显著低于对照组(P<0.01),S期细胞的数量显著高于对照组(P<0.01),表明NR2F2基因可以改变细胞周期,促进G1期向S期转变,从而促进细胞增殖(图2G、H)。通过流式细胞仪检测过表达NR2F2基因对细胞凋亡的影响,结果发现,过表达NR2F2基因后,早凋细胞占比增多,晚凋细胞占比减少,表明NR2F2基因可以抑制细胞的凋亡(图2I)。通过划痕试验检测NR2F2基因对细胞迁移的影响,结果表明,过表达NR2F2基因后,细胞迁移速度加快,在48 h后基本汇合,而对照组细胞还未完全融合(图2J)。

2.3 NR2F2与Smad4物理结合并调控其表达进而影响下游基因的表达

为了确定NR2F2基因调控细胞增殖的具体机制,本研究通过蛋白相互作用软件预测了一些与NR2F2相互作用的蛋白。发现能与NR2F2互作的蛋白有15个,其中我们将关注点聚焦在Smad4蛋白上(图3A)。进行了Co-IP分析来检测NR2F2和Smad4之间的相互作用。用Flag标签蛋白调取与它结合的复合物,能检测到Smad4蛋白,说明NR2F2蛋白能与Smad4蛋白相互作用行使功能(图3B)。

为了探究NR2F2基因是否调控Smad4基因的表达,检测了过表达和敲除NR2F2基因对Smad4基因表达的影响,发现过表达NR2F2基因后,Smad4基因表达量升高(P<0.01,图4A),下游基因CyclinB、CDK1、CDK4、CyclinD1表达量均显著上升(P<0.01,P<0.05,图4C);而敲除NR2F2基因后,Smad4基因表达量降低(P<0.01,图4B),下游基因CyclinB、CDK1、CDK4、CyclinD1表达量均显著下降(P<0.01,图4D)。

A.过表达NR2F2后Smad4的表达变化;B.敲除NR2F2后Smad4的表达变化;C.过表达NR2F2后Smad4调控的下游基因的表达变化;D.敲除NR2F2后Smad4调控的下游基因的表达变化。不同大写字母表示差异极显著(P<0.01);不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同

挽救试验中,在过表达NR2F2基因后,干扰Smad4基因表达,Smad4表达量显著降低(P<0.01,图5A),且能够显著缓解过表达NR2F2基因引起的Smad4下游基因CyclinD1、CyclinB、CDK1的表达的升高,降低了它们的表达量(P<0.01,P<0.05,图5B)。通过检测增殖相关基因的表达,结果发现,干扰Smad4基因表达,能缓解过表达NR2F2基因对细胞增殖的影响,PCNA和Ki67的表达量显著降低(P<0.01,P<0.05,图5C)。

A.干扰Smad4的效率;B.过表达NR2F2且干扰Smad4后下游基因表达的变化;C.过表达NR2F2且干扰Smad4后增殖基因表达的变化

3 讨 论

NR2F2作为一种转录因子,在细胞的生命过程中起着重要的作用。啮齿类动物的遗传模型揭示了NR2F2基因在脂肪形成、脂质代谢、肝脏糖异生、胰岛素分泌和血压调节等生物过程中的重要作用[25-27]。本研究发现,在PK15细胞中,NR2F2基因促进细胞增殖。NR2F2基因对PK15细胞的生长促进作用是通过加速细胞周期从G1期到S期的进程来介导的。这些结果表明,NR2F2基因能促进细胞增殖。在之前的研究中,NR2F2已被证明在细胞的增殖中发挥促进作用。NR2F2在多种肿瘤细胞中高表达,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡[28]。在肾细胞癌细胞中,下调NR2F2可通过上调BRCA1来抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡[29]。NR2F2通过调节IGF-1表达来调节小鼠出生后小脑的生长和成熟[30]。过表达NR2F2基因可改变细胞粘附蛋白和细胞增殖的表达[31]。敲除NR2F2后,Ki67基因表达减少,细胞增殖被抑制,凋亡细胞增加[32]。NR2F2沉默后,细胞增殖和侵袭减少,细胞被阻断在G1期[33]。可见,NR2F2基因在细胞增殖中起着重要作用,但其具体的作用机制还需进一步研究。

NR2F2基因属于核受体转录因子家族。作为一种转录因子,NR2F2不直接调节激酶活性。NR2F2可能通过调节其他基因的表达来调节激酶活性。在不同的细胞模型中,ERα、CEBP/α、Wnt10b已被证明受NR2F2的调控。在本研究中,通过蛋白质相互作用软件预测了一些与NR2F2相互作用的蛋白质,发现有15个蛋白可以与NR2F2相互作用,其中,Smad4比较值得注意。本研究采用Co-IP直接验证了PK15细胞中NR2F2蛋白与Smad4蛋白的结合。而过表达NR2F2可提高Smad4的水平。NR2F2的沉默可降低Smad4的水平。这说明NR2F2可能改变了Smad4基因的表达。

Smad4为抑癌基因,属于Smad家族。转化生长因子-β(TGF-β)信号可以通过以下反应激活:1)TGF-β与受体结合,然后诱导Smad2/3磷酸化;2)共同介质Smad4与磷酸化的Smads结合,然后迁移到细胞核;3)Smad复合物与各种转录因子相互作用,然后调节细胞的增殖和迁移。先前的研究表明,Smad4的缺失会影响细胞的增殖和迁移。敲除Smad4的细胞增殖较慢,细胞迁移减少[34-35]。miR-144可以靶向Smad4基因,降低Smad4基因的表达,从而抑制细胞增殖和迁移[36]。Smad4基因表达水平的降低增加了对DNA拓扑异构酶抑制剂的敏感性,促进细胞凋亡,从而抑制细胞增殖[37]。这些研究表明Smad4可以调节细胞周期。

TGF-β信号通路在组织发育、稳态和修复中起着重要作用,并调控细胞增殖、分化、凋亡和迁移等细胞过程[38-39]。Smad4作为唯一的通用受体和TGF-β信号通路的中介,在将受体信号转导到核中的靶基因中起核心作用[40]。Smad4的异常表达可引起细胞中TGF-β超家族成员的异常变化,影响下游靶基因的表达,并影响细胞的生长发育。细胞增殖周期相关因子是TGF-β信号通路的下游效应因子[41]。研究发现,敲除NR2F2可以显著下调细胞周期相关基因的表达;而过表达NR2F2可显著上调细胞增殖周期相关基因的表达。挽救试验中过表达NR2F2和干扰Smad4后,可以有效缓解过表达NR2F2基因的影响。这说明NR2F2通过与Smad4相互作用,影响TGF-β信号通路,从而影响细胞增殖周期相关因子的表达。因此,发现NR2F2通过影响Smad4基因的表达来影响细胞增殖。

4 结 论

过表达NR2F2基因后促进了细胞的增殖,抑制了凋亡,且NR2F2蛋白能与Smad4蛋白结合并影响Smad4基因的表达,进而影响下游基因的表达。