乳腺癌中LAMC2表达及临床意义的生物信息学分析

赵硕,张庆雪,李靖若

(郑州大学第一附属医院 乳腺外科,河南 郑州 450000)

乳腺癌是常见的癌症,约占女性癌症的30%[1]。乳腺癌具有异质性,根据激素受体、人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)和Ki-67的状态可以分为4种亚型,不同分型乳腺癌的治疗方案不同,遵循个体化治疗原则[2]。随着乳腺癌综合治疗的完善,乳腺癌患者的生存率已经逐年提高。但是仍有部分患者对化疗、免疫治疗存在耐药且部分年轻患者出现早期转移[3]。因此,挖掘新型生物标志物对乳腺癌早期诊断、靶向治疗及预后评估有着重要的临床意义。

层粘连蛋白亚基γ2(laminin subunit γ2,LAMC2)基因编码层粘连蛋白(laminin,LM)γ2链,位于人类染色体1q25-q31上,是LM-332蛋白的重要组成成分。LM-332参与组成基底膜,对细胞分化和运动、维持组织表型和促进组织存活起重要作用[4]。已有研究表明LAMC2在肺腺癌、食管鳞状细胞癌和肝癌等肿瘤中表达异常[5-8]。Henning等[9]发现LAMC2在良性乳腺上皮基底膜中连续性表达,在浸润性乳腺癌中表达缺失。本文将通过生物信息学分析进一步挖掘LAMC2在乳腺癌中的表达及临床意义,为研究LAMC2基因在乳腺癌发生中的作用机制及潜在价值提供线索。

1 资料与方法

1.1 GEPIA2数据库

GEPIA2数据库(http://gepia2.cancer-pku.cn/)是对来源于TCGA和GTEx数据库中的肿瘤和正常样本数据进行在线分析及可视化的工具。本研究利用GEPIA2工具中 “Expression DIY”的“Box Plot”功能,探索目标基因LAMC2在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达差异,设置条件:|Log2FC|cut off选择“1”,P-value cut off为“0.01”,Log Scale为“Yes”,正常样本选择TCGA以及GTEx数据库。利用GEPIA2工具中“Expression DIY”的“Correlation Analysis”功能,探索LAMC2和肿瘤干细胞标志物CD44、CD133之间的关系,设置条件:Correlation Coefficient为“Pearson”,TCGA Tumor为“BRCA Tumor”。

1.2 UALCAN数据库

UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu)用来补充验证LAMC2在乳腺癌中不同淋巴结转移状态、不同分期、不同分子分型中的表达差异,并探究LAMC2表达与基因甲基化水平的关系。设置筛选条件:(1)Enter gene symbol为“LAMC2”;(2)TCGA dataset为“Breast invasive carcinoma”;(3)Links for analysis为“Expression/Methylation”;(4)based on为“Sample types/Individual cancer stages/Major subclasses/Nodal Metastasis status”。

1.3 HPA数据库

HPA数据库网址为https://www.proteinatlas.org。通过深度测序转录和免疫组织化学,提供了包含32个组织和47个细胞系的RNA和蛋白质水平的基因表达数据,提供了蛋白质在每个组织和器官的亚细胞中的定位。本研究在HPA数据库中输入目的蛋白LAMC2,在“Tissue”“Pathology”和“Subcell”3个模块处分别获取LAMC2蛋白在正常乳腺组织、乳腺癌组织中的免疫组织化学图片及亚细胞定位。

1.4 TIMER2.0数据库

TIMER2.0数据库(http://timer.cistrome.org)提供对肿瘤浸润性免疫细胞的全面分析和可视化功能。本研究用TIMER2.0数据库中的“Gene”和“Mutation”模块,探索LAMC2基因的表达及突变状态和乳腺癌肿瘤微环境中的6种免疫细胞(B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞)浸润的关系。

1.5 KM Plotter数据库

KM Plotter数据库(https://kmplot.com/analysis/)是一种可以分析基因与癌症患者预后关系的在线分析工具,其数据来源于GEO、EGA和TCGA数据库。本研究首先选择mRNA gene chip中的“Start KM Plotter for breast cancer”,设置条件:Affymetrix ID为“LAMC2(202267_at)”,Survival为“OS”,选择“Auto select best cut off”为最佳截断值,根据目标表达量将乳腺癌患者分为高低表达两组,分别选择不同的临床病理参数(分子分型、组织学分级、淋巴结状态),对其进行总生存期分析。其次选择“mRNA RNA-seq”中的“Start KM Plotter for pan-cancer”,设置条件:Gene symbol为“LAMC2”,选择“Breast cancer”,选择不同的免疫细胞状态对其进行总生存期分析。获得生存曲线风险比(hazards ratio,HR)、95%可信区间(95% confidence interval,95% CI)和P值。

1.6 统计学方法

两组数据间的比较,若数据服从正态分布,使用独立样本比t检验,若不服从正态分布,则使用U检验。TIMER2.0数据库中,使用Spearman秩相关分析探索LAMC2基因表达量及突变状态与免疫细胞浸润水平的关系; KM Plotter工具中LAMC2基因的表达与乳腺癌患者预后关系的生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制,并使用 log-rank检验对两组生存曲线进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LAMC2基因相对表达量

与正常组织相比,LAMC2在乳腺癌组织中表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)(图1A、1B)。进一步分析乳腺癌中LAMC2的表达和临床病理的关系,发现三阴性乳腺癌与Luminal型和HER-2过表达型乳腺癌相比LAMC2的表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)(图1C)。LAMC2的表达水平和淋巴结状态相关(图1D),N3分别与N0及N1相比,LAMC2表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)。在不同乳腺癌分期中,LAMC2的表达差异无统计学意义(P>0.05)(图1E)。

A为GEPIA数据库中LAMC2的差异表达;B为UALCAN数据库中LAMC2的差异表达;C为LAMC2在不同分子分型中的表达;D为LAMC2在不同淋巴结转移状态下的表达;E为LAMC2在不同分期中的表达。

HPA数据库中,LAMC2属于人类疾病相关基因。免疫组织化学染色示LAMC2蛋白在乳腺癌组织中相对于正常乳腺组织中低表达,亚细胞定位示LAMC2在内质网和高尔基体中的表达并且被认为是分泌蛋白(图2)。

A为正常乳腺组织;B为乳腺癌组织;C为亚细胞定位。

2.2 LAMC2基因与甲基化之间的关系

LAMC2是1个超甲基化基因,且在乳腺癌和正常乳腺中甲基化水平不同,差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。

图3 乳腺癌和正常乳腺组织中LAMC2基因甲基化水平

2.3 LAMC2与乳腺癌干细胞及免疫细胞浸润之间的关系

利用GEPIA2数据库在线分析,LAMC2基因的表达和乳腺癌干细胞标志物CD44、CD133的表达水平均呈正相关(图4)。

图4 乳腺癌中LAMC2的表达和CD44、CD133的关系

通过TIMER2.0数据库探索LAMC2基因表达与乳腺癌肿瘤微环境中6种免疫细胞浸润水平的关系,见图5。LAMC2基因的表达水平与B细胞浸润水平呈正相关,与CD8+T细胞、树突状细胞、中性粒细胞的浸润水平呈负相关。进一步探索免疫细胞浸润和LAMC2基因突变状态之间的关系,仅B细胞浸润水平和LAMC2基因突变有关,在LAMC2突变组B细胞浸润水平相对升高,差异有统计学意义(P<0.05),其他5种免疫细胞浸润水平和LAMC2突变状态相关性不强,差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 LAMC2基因表达与乳腺癌患者总生存期的关系

与LAMC2低表达患者相比,LAMC2高表达患者有更长的总生存期,差异有统计学意义(P<0.05),见图6。

A为基于mRNA的基因芯片数据进行生存分析;B为基于mRNA的RNA测序数据进行生存分析。

2.4.1不同临床病理下乳腺癌患者LAMC2基因表达与总生存期的关系

在Luminal A型乳腺癌、乳腺癌组织学Ⅰ级、Ⅱ级和淋巴结未转移患者中,LAMC2的表达和患者总生存期呈正相关,差异有统计学意义,见表1。

表1 不同临床病理特征下LAMC2基因表达与乳腺癌患者总生存期的关系

2.4.2不同免疫细胞浸润下乳腺癌LAMC2基因表达与总生存期的关系

在肿瘤微环境B细胞浸润减少型、CD8+T细胞减少型、富含巨噬细胞型或巨噬细胞减少型中,LAMC2高表达者预后较好,见表2。

表2 不同免疫细胞浸润水平下LAMC2表达和乳腺癌患者总生存期的关系

3 讨论

癌细胞突破基底膜向间质浸润是转移的第一步,LM是基底膜的主要组成成分。基底膜中的LM γ2亚基参与半桥粒复合体的组成,半桥粒复合体是上皮细胞稳定黏附到基底膜上的结构支持[10]。正常乳腺组织含有半桥粒复合体,浸润性乳腺癌缺少半桥粒复合体,在肿瘤中,它们的缺失可能与正常细胞结构的丧失有关,从而使癌细胞易穿透基底膜发生迁移[11]。LAMC2在多种肿瘤中出现表达异常[8]。通过生物信息学分析LAMC2在乳腺癌中的表达和临床意义,挖掘其作为乳腺癌潜在生物标志物的价值。

本研究通过数据库分析发现LAMC2基因在乳腺癌组织中表达下调,且LAMC2基因的表达与乳腺癌分子分型及淋巴结转移状态密切相关,三阴性乳腺癌中LAMC2的表达和Luminal型和HER-2过表达型乳腺癌相比上调,这和Carpenter等[12]的研究结果一致,LMγ2亚基参与组成的LM-332在三阴性乳腺癌中表达,在雌激素受体阳性的乳腺癌中不表达。LAMC2低表达乳腺癌患者的总生存期更短,且LAMC2和患者预后的关系受临床病理的影响。这些结果提示LAMC2基因的异常表达与乳腺癌的发生发展有关。分析原因,LAMC2基因低表达影响LM-332亚型的合成,进行破坏了基底膜的正常结构和正常导管结构丧失[13],半桥粒复合体合成障碍,使癌细胞在向周围组织浸润过程中失去了基底膜保护屏障。LMγ2亚基可以在基质金属蛋白酶的作用下水解产生至少两个表皮生长因子样序列的DⅢ片段,水解释放的DⅢ片段通过结合表皮生长因子受体并介导的细胞内信号,促进乳腺癌细胞的迁移[14]。乳腺癌组织中可能存在LMγ2亚基和DⅢ片段比例的失调,即低LM γ2亚基/高DⅢ片段状态。LAMC2在乳腺癌中低表达可能和乳腺癌中基质金属蛋白酶上调有关[15]。

通过数据库分析发现在乳腺癌中LAMC2是一个超甲基化基因,甲基化可能是LAMC2基因低表达的机制之一。但数据库中乳腺癌LAMC2基因甲基化水平相对正常乳腺组织低,可能是因为基因之间存在互作关系,上游基因甲基化水平高、存在MicroRNA的调节或者其他通路的影响,导致乳腺癌中LAMC2表达下调,具体机制需要进一步研究。此外,脑转移和肺转移是晚期乳腺癌患者生活质量下降和预后不良的主要原因[3]。在小鼠乳腺癌脑转移动物模型中,异型肿瘤-星形胶质细胞相互作用发生局部黏着斑激酶磷酸化,诱导脑转移微环境中的LAMC2表达和LM-332的沉积,从而调控乳腺癌细胞在大脑中的定植[16]。在乳腺癌肺转移微环境中由LMγ2亚基参与构成的LM-332蛋白在高浓度下可以促进乳腺癌细胞的迁移[17]。总之,LAMC2基因正常表达是维持正常乳腺上皮细胞的表型的前提,在乳腺癌组织中的低表达和乳腺癌的发生有关,在脑或肺转移微环境中的高表达和乳腺癌细胞的转移定植有关。

利用GEPIA2数据库分析发现乳腺癌中LAMC2的表达和肿瘤干细胞标志物CD44、CD133呈正相关。CD44是重要的乳腺癌干细胞标志物,乳腺肿瘤中高占比的乳腺癌干细胞已被证明与不良后果相关[18]。Sato等[19]研究发现LMγ2的氨基酸末端片段通过与CD44的相互作用刺激侵袭性乳腺癌细胞的迁移。Brugnoli等[20]发现CD133可以作为非侵袭性和侵袭性乳腺肿瘤细胞恶性程度增加的指标,直接调节与转移和耐药相关的蛋白的表达。本研究通过数据库分析发现LAMC2在三阴性乳腺癌中的表达相对Luminal型和HER-2过表达型上调,可能和三阴性乳腺癌中富含肿瘤干细胞有关[21];此外,LAMC2还可以通过LncRNA T376626促进三阴性乳腺癌细胞增殖和转移[22]。乳腺癌干细胞的主要免疫抑制特征之一是程序性死亡受体-配体1的表达,与效应T细胞的细胞表面程序性死亡受体1结合,导致其衰竭[23]。

通过数据库分析发现乳腺癌中LAMC2的表达水平和与患者总生存期的关系受肿瘤微环境中免疫细胞浸润水平的影响。研究发现在非小细胞肺癌和食管鳞状细胞癌中LMγ2亚基被癌症相关成纤维细胞分泌的转化生长因子-1通过JNK/AP1信号转录激活,该信号通过改变T细胞受体的表达阻止了T细胞向肿瘤巢穴的浸润,减弱对抗程序性死亡受体1疗法的反应[24]。免疫抑制剂可用于治疗程序性死亡受体-配体1阳性的晚期三阴性乳腺癌[25]。三阴性乳腺癌中LAMC2的表达相对其他乳腺癌分型上调,可能通过介导免疫细胞参与免疫逃逸,部分患者产生耐药。在胰腺癌中LAMC2的表达可以预测患者对吉西他滨耐药的治疗反应[26]。在三阴性乳腺癌中LAMC2的表达是否可以预测抗程序性死亡受体1疗法的反应有待进一步研究。本研究有一定的局限性,利用生物信息学分析获得的结果还需要进一步临床和实验验证。

4 结论

LAMC2基因在乳腺癌中表达下调且其表达与乳腺癌总生存期的关系受不同临床病理因素的影响,LAMC2基因的表达和肿瘤微环境中的肿瘤干细胞和免疫细胞浸润水平有关。这些结果可以为LAMC2基因与乳腺癌关系的研究提供线索,监测LAMC2表达可以为乳腺癌的治疗及预后评估提供重要的参考价值。