环状RNA功能及与眼科相关疾病关系研究进展

徐梓凡,郑昊涵,谢田华,王晓露,姚 勇

(南京医科大学附属无锡人民医院眼科,江苏 无锡 214023)

非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)包括小RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)、环状RNA(circular RNA,circRNA)等,是由基因组转录而成的不编码蛋白质的RNA,被认为在许多人类疾病的基因表达和进展中发挥重要作用[1]。其中,circRNA不同于经典的线性RNA,不具有5’末端帽和3’末端poly-A尾,而是通过共价键形成单链闭合环状结构[2]。早在1976年,circRNA作为类病毒首次被报道,在后来的几十年间它们因被认为是剪接错误的产物而被忽视,后来才被发现是真核生物中内源性RNA的剪接产物[3]。随着RNA高通量测序技术和生物信息学的发展,Hansen等[4]于2013年首次报道了环状RNA海绵miR-7 (circular RNA sponge for miR-7,ciRS-7)通过“海绵状”吸附miR-7发挥生物学作用。目前,研究发现circRNA的功能包括作为miRNA海绵[5]、与蛋白质相互作用[6]、调节转录和干预剪接过程[7],甚至可以翻译产生多肽或蛋白质[8],在血管性疾病、炎症性疾病、神经系统疾病和恶性肿瘤等多种疾病中发挥重要的生物学作用[9-10]。近年来,有研究[11-12]报道,circRNA的表达变化在眼睛的组织发育和眼病的进展中产生重大影响。因此,circRNA可能是眼病的诊断、治疗及预后评估过程中重要的生物学标志物和干预靶点,其中具体的作用和分子机制,还需要更多的研究去探索。

1 circRNA的特征

circRNA是一类不具有5’末端帽和3’末端poly-A尾巴,通过反向剪接机制形成环形结构的内源性ncRNA。RNA测序技术证实,circRNA在真核生物中广泛表达,在某些情况下其丰富度可能超过同源线性RNA[7,13]。circRNA的独特环形结构使它们比线性RNA具有更长的半衰期和更强的核糖核酸酶抗性,不易被降解,从而稳定地存在于真核细胞中[14]。此外,多个研究证实circRNA还具有保守性和组织特异性,可以在许多疾病中发挥特殊的分子标记作用[13-15]。真核生物中大多数的circRNA可以根据其组成序列的不同分为三个亚型:①外显子circRNA(ecircRNA),由一个或多个外显子环化而产生;②外显子-内含子circRNA(elciRNA),由保留内含子的外显子环化而成;③内含子circRNA(ciRNA),仅由内含子环化而成[16]。

2 circRNA的形成机制

circRNA的形成机制主要分为两种模型,包括套索驱动环化和内含子配对驱动环化。在单个基因位点上,两种模型都发生选择性剪接,可以产生包含不同内含子和外显子组合的各种circRNA[15]。

2.1 内含子配对驱动环化模型[15-17]先进行反向剪接生成带有外显子和内含子的环形结构,然后加工生成circRNA。侧翼内含子配对由重复的侧翼内含子序列驱动,例如反向重复的Alu元件或反向互补匹配碱基(RCM),使剪接位点接近形成环状结构,然后剪掉内含子形成circRNA[18]。此外,一些反式作用因子在circRNA的产生过程中也起到一定的作用,多种RNA结合蛋白(RBP)例如盲肌(MBL)、选择性剪接因子Quaking(QKI)和RNA编辑酶腺苷酸脱氨酶(ADAR1),已被报道可以与环状外显子两侧的内含子中的特定靶标结合,并通过蛋白质之间的相互作用调控环化[7,19-20]。侧翼内含子结合位点的QKI二聚体高效表达可以促进circRNA的产生[19]。与之相反,ADAR1可通过干扰RNA配对抑制circRNA的形成,从而减少circRNA的数量[20]。

2.2 套索驱动环化模型[15]首先形成典型的线性RNA,然后通过外显子跳跃生成套索结构。内含子被移除后形成ciRNA,剩余的结构通过内剪接头尾相连,产生ecircRNA或elciRNA。

3 circRNA的功能

3.1 作为miRNA的分子海绵 外显子circRNA含有miRNA识别元件(MREs),可作为海绵吸附体竞争性结合miRNA,抑制其与mRNA结合,从而靶向基因的翻译[4]。

3.2 与蛋白质的相互作用 蛋白质和circRNA之间的相互作用非常复杂,circRNA可以作为蛋白质的转运体、诱饵或支架,调节蛋白质之间的相互作用及其活性[21]。

3.3 调控基因转录、剪接和翻译 细胞核中的circRNA可以调控基因的转录和剪接,circRNA与RNA聚合酶Ⅱ通过特定的RNA-RNA相互作用,促进同源基因的转录[22]。此外,circRNA可以通过调节基因剪接,或者通过竞争RNA结合蛋白(RBPs)来调节基因翻译[23]。

3.4 翻译成多肽或蛋白质 当circRNA序列中存在内部核糖体启动位点(IRES)时,已经被证明可以在体内和体外翻译[24],也可以由N6-甲基腺苷(M6A)修饰以不依赖5’帽的方式驱动[25]。

3.5 生成假基因 与mRNAs类似,circRNA有可能被逆转录,并整合到宿主基因组中,以产生假基因,参与多种生理和病理过程中DNA、RNA或蛋白质水平的调节[26]。

3.6 调控表观遗传 circRNA可以调节表观遗传修饰,例如DNA或组蛋白甲基化[27]。

4 circRNA与眼科相关疾病

4.1 糖尿病视网膜病变 糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病的主要并发症,也是全球范围内视力下降、致盲的罪魁祸首[28]。视网膜微血管功能障碍(包括视网膜无灌注、血管通透性增加和病理性的视网膜血管新生等)和神经变性(包括神经细胞凋亡和胶质细胞功能障碍等)参与了DR的发生和发展[29]。血管内皮生长因子(VEGF)的异常表达和其他因素,如晚期糖基化终末产物、氧化应激、活化的蛋白激酶C(PKC)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路,也被认为是DR血管功能障碍的分子基础[28]。高糖可以显著的引起视网膜血管内皮细胞的损伤,增加血管渗出和黄斑水肿,促进病理性的视网膜血管生成等[30]。之前的一项研究通过高通量circRNA微阵列分析检测了circRNA表达谱的差异,发现circ-0005015在DR患者的血浆、玻璃体和视网膜前纤维血管膜(FVM)中显著上调[31]。circRNA可以通过分泌在细胞外囊泡 (EVs)中或组装成核糖核蛋白复合物,而在体液中被检测到。研究发现,circ-0005015充当miR-519d-3p海绵来抑制其活性,增加基质金属蛋白酶-2(MMP-2),X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)和信号转导和转录激活因子3(STAT3)的表达,促进内皮细胞生长、增殖和迁移,参与病理性的视网膜血管生成[31]。在高糖刺激的内皮细胞和DR患者的临床样品中,circHIPK3和circCOL1A2的表达上调,circHIPK3通过特异性吸附miR-30a-3p,激活血管内皮生长因子-C(VEGF-C)/FZD4/WNT2的调节网络,参与了DR视网膜血管功能障碍的进展[32]。与其类似,circCOL1A2通过调节miR-29b/VEGF轴,参与DR小鼠的血管生成[33]。另有研究表明,circ-0002570/miR-1243/AMOT(angiomotin)轴[34]和cZNF609/miR-615-5p/MEF2A轴以ceRNA机制调控DR的进展[35]。在高糖环境中,作为miR-20b-5p海绵的circDNMT3B表达下调,进而下调骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂(BAMBI),促进了人视网膜微血管内皮细胞的增殖、迁移和管状形成;过表达circDNMT3B可以减少糖尿病大鼠视网膜无细胞毛细血管数量,减轻视力损害[36]。

视网膜血管中的血管内皮细胞和周细胞之间的串扰对于血管的稳态和重塑是至关重要的。然而,糖尿病时,周细胞的缺失,可以导致视网膜血管渗漏、闭塞和新血管的形成。Jiang等[37]报道,CZNF532在糖尿病应激下的周细胞中表达上调。与其类似,Liu 等[38]研究发现cPWWP2A在周细胞中表达上调,而在内皮细胞中的表达没有统计学差异。DR时,高血糖和氧化应激可以诱导转录因子特异性蛋白1(SP1)的表达。已证实SP1通过与cZNF532启动子区域结合,激活cZNF532转录。增加的cZNF532作为海绵吸附miR-29a-3p而抑制其活性,诱导硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、赖氨酰氧化酶样蛋白2(LOXL2)和细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)表达增加,从而促进周细胞增殖以及周细胞向内皮细胞的募集[37]。高血糖环境下,周细胞变性还会导致视网膜毛细血管细胞的进行性丧失,以及脱细胞毛细血管和微动脉瘤的产生。CZNF532基因敲除或miR-29a-3p过表达可加重STZ诱导的视网膜周细胞变性和血管功能障碍,增加未灌注的无细胞毛细血管和微动脉瘤的数量[37]。周细胞来源的cPWWP2A通过吸附miR-579,调节血管生成素1(Ang1)/闭合蛋白(occludin)沉默信息调节因子1(SIRT1)通路,从而影响周细胞覆盖率和血管完整性。此外,cPWWP2A可以以细胞外囊泡为载体,调控内皮细胞的结构和功能[38]。CPWWP2A的过表达或抑制其下游分子miR-29a-3p和miR-579,可消除糖尿病引起的视网膜血管通透性增高和周围细胞覆盖率降低的影响,延缓视网膜血管功能紊乱的进展[38]。

另外,最近两项研究发现circ-0041795[39]和circ-0084043[40]在高糖诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞中异常表达,参与了糖尿病条件下的视网膜血管的功能障碍。circ-0041795作为海绵吸附miR-646,靶向VEGF-C,参与HG诱导的ARPE-19细胞分泌促炎因子,如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)等水平的调节[39]。circ-0084043通过海绵样吸附miR-140-3p,靶向转化生长因子α(TGFα);沉默circ-0084043可以显著降低氧化应激的水平,降低丙二醛(MDA)的含量,提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性,从而抑制高糖诱导的炎性反应和细胞凋亡[40]。

4.2 年龄相关性黄斑变性 年龄相关性黄斑变性(AMD)根据临床表现和病理改变的不同 AMD 分为两型:萎缩性 AMD(非渗出型 AMD,或干性型 AMD) 与渗出型 AMD(湿性型 AMD)。RPE、脉络膜毛细血管和光感受器的萎缩是萎缩性AMD的特征[41]。研究发现,线粒体活性氧的产生促进RPE的去分化,是导致萎缩性AMD发生发展的重要因素[42]。最近的一项研究发现RPE细胞胞质中的circNR3C1含有多个miRNA结合位点[43]。circNR3C1可以作为海绵结合miR-382-5P,竞争内源性RNA,靶向磷酸酶基因(PTEN)/AKT/mTOR信号通路。而沉默了circN3C1,miR-382-5P活性增强,RPE特征性转录本和蛋白水平降低,吞噬作用被抑制,线粒体活性氧产生增多,促进了RPE超微结构的损伤和功能障碍,进而加剧了萎缩性AMD的疾病进展[44]。

渗出性AMD的典型表现是脉络膜的新生血管(CNV)突破Bruch膜进入视网膜色素上皮(RPE)或隐藏在视网膜下,造成视网膜水肿、渗出、出血等功能障碍,严重的还会造成视力下降。在激光诱导小鼠CNV脉络膜中,CZBTB44的表达显著上调[45]。CZBTB44作为miR-578海绵,抑制miR-578活性,导致血管内皮生长因子A(VEGFA)和血管细胞黏附分子-1(VCAM1)表达增加;沉默cZBTB44可以延缓激光诱导的CNV的进展[45]。

4.3 角膜疾病 Wu等[46]重点探索了cZNF609在角膜血管新生调控中的生物学作用。角膜缝合术后角膜上皮中的cZNF609表达持续上调,miR-184表达持续下调。cZNF609通过抑制miR-184的活性,促进AKT/β-catenin/VEGF信号转导通路的激活,促进内皮细胞增殖、迁移和管状形成,从而调控角膜新生血管。然而,cKifap3的作用相反,cKifap3可以显著抑制内皮细胞的增殖、迁移和成管能力[47]。

4.4 青光眼 直接或间接改善视网膜神经变性是预防、延缓和逆转青光眼所致视网膜神经变性的一种很有前途的治疗方法。血管和神经是体内两个重要的通道,可以相互作用,通常具有共同的分化、生长调节功能[48]。之前有研究证明CZNF609参与了缺血诱导的视网膜血管功能障碍[35]。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在青光眼视网膜神经变性过程中明显增高,视网膜胶质细胞被激活,通过释放细胞因子、活性氧(ROS)或一氧化氮(NO)等途径,导致谷氨酸受体的生物合成下降,加重神经元损伤,造成RGC凋亡[49]。最近的两项研究发现CZNF609和CZRANB1的表达水平在青光眼引起的视网膜神经变性中显著上调,通过调节Müller细胞功能,间接调节RGC功能,在视网膜神经退行性变中起着重要作用[50-51]。CZNF609作为miR-615海绵,抑制miR-615活性,上调METRN基因表达,而CZRANB1通过CZRANB1/miR-217/RUNX2组成的调控网络调节Müller细胞功能,进而影响视网膜神经退行性变的发生发展[50-51]。沉默了CZNF609和CZRANB1可以显著抑制视网膜反应性胶质细胞增生,减少Müller细胞对视网膜节细胞的有害影响,促进视网膜节细胞在青光眼中的存活。

4.5 白内障 晶状体上皮细胞(LECs)的凋亡和氧化损伤被报道参与了晶状体蛋白氧化、降解、聚集和交联,是非先天性白内障发生和发展的共同分子基础[52]。有研究报道circHIPK3的异常表达与人晶状体上皮细胞的凋亡和增殖有关,circHIPK3/miR-193a-3p/α-晶状体蛋白(CRYAA)网络参与了体外LECs功能的调节[53]。最新研究发现,过表达circHIPK3可以显著抑制miR-221-3p的水平,激活PI3K/AKT通路,通过调节氧化应激标志物,如MDA和GSH-PX的水平,进而减少了LECs的损伤和凋亡[54]。这些新发现也提供了新的线索和潜在的治疗目标,以揭示年龄相关白内障(ARC)的发病机制。另一项研究分析了糖尿病相关的白内障患者晶状体组织中差异表达的circRNA,其中circKMT2E的表达比正常组织高2倍以上,与miR-204-5p的表达趋势相反。

5 结 语

随着科技的发展,越来越多的研究表明了circRNA的异常表达与眼科疾病的进展密切关系。circRNA作为一类新的内源性lncRNA,可能在白内障、青光眼、DR等眼部疾病的进展中发挥重要作用。circRNA在患者的血浆、房水等中可以被检测到,可作为潜在的生物标志物和预后评估指标;并且生物合成的circRNA有希望成为治疗干预手段。然而,仍有许多未知的circRNA在眼病的发生和发展过程中扮演着重要的调控角色。此外,相较于miRNA和lncRNA,circRNA在眼部生物学过程中的作用及分子机制仍有许多空白,迫切需要更多的研究去探索。