白芷生物碱提取工艺研究

严祖贤 王 娣 胡晓婷 吴 佳 许庭娇 牛文艳

（蚌埠学院食品与生物工程学院，安徽蚌埠 233030）

白芷（Angelica dahurica）是一种常用中药，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓之功效。根据产地的不同，可以分为川白芷、杭白芷、禹白芷、祁白芷等。许多经典方剂如川芎茶调散[1]、九味羌活汤[2]、柴葛解肌汤[3]等均有此味药入药。研究表明，白芷中含有香豆素类、微量元素、苷类、挥发油类、黄酮类、多糖类、氨基酸类、生物碱类等多种活性成分。白芷具有抗炎、镇痛、抗菌、抗肿瘤、美白、舒张血管、抗过敏等多种药理作用，在临床上得到了广泛应用[4]。白芷气味芳香，除供药用外，还可用于医学美容、香料、食品添加等。

生物碱的传统提取方法主要有水或酸水提取法、醇类溶剂提取法、亲脂类有机溶剂提取法、浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流法等。生物碱提取新技术主要有微波辅助萃取技术、超声辅助提取技术、超临界流体萃取技术、双水相萃取技术、色谱法、树脂吸附法等[5]。

1 材料、试剂和仪器

1.1 材料

白芷购于安徽省亳州市，自然风干，置于阴凉干燥处避光储存备用。

1.2 试剂

罂粟碱标准品（中国药品生物制品鉴定所）；无水乙醇、浓盐酸、醋酸、醋酸钠、氢氧化钠、三氯甲烷、溴甲酚绿、氨水等均为国产分析纯，购自天津市永大化学试剂有限公司；去离子水为实验室自制。

1.3 仪器

LD-T200A 高速万能粉碎机，上海顶帅电器有限公司；SK-1漩涡振荡器，金坛市白塔新宝仪器厂；HH-1 数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；722可见分光光度器，上海菁华科技仪器有限公司；旋转蒸发器RE-2000B，巩义市予华仪器有限责任公司；SHZ-Ⅲ循环水式真空泵，南京科尔仪器设备有限公司；手持式酸度计PH-100pro+，上海力辰邦西仪器科技有限公司。

2 试验方法

2.1 白芷预处理

白芷干燥粉碎后过60目筛，于棕色瓶中低温密封保存，备用。

2.2 生物碱含量测定

2.2.1测定波长选择通过对盐酸罂粟碱的全波长扫描结果，选择在416 nm下进行测定[6]。

2.2.2标准品对照品溶液配制精密称取盐酸罂粟碱标准品15.40 mg，用0.01 mol/L的盐酸溶解，稀释并定容至250.00 mL容量瓶中，即浓度为61.60 µg/mL盐酸罂粟碱标准溶液，备用。

2.2.3醋酸盐缓冲液及溴甲酚绿溶液配制取0.20 mol/L醋酸溶液250.00 mL，用0.20 mol/L醋酸钠溶液调节pH至3.1，备用。取溴甲酚绿50.00 mg，加0.50 mol/L氢氧化钠液1.60 mL，加水至100.00 mL，用三氯甲烷提取3次，每次30.00 mL，弃去三氯甲烷液，备用。

2.2.4标准曲线测定方法取盐酸罂粟碱标准品溶液0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mL 分别置于分液漏斗中，依次加入2.00、1.75、1.50、1.25、1.00、0.50、0.01 mol/L盐酸溶液，各精密滴加入醋酸盐缓冲溶液5.00 mL、溴甲酚绿2.00 mL、三氯甲烷8.00 mL，重复振荡，静止2 h，取氯仿层，于416 nm处测定吸光度（A）。以吸光度值为纵坐标（y），盐酸罂粟碱标准品溶液为横坐标（x）。以0.01 mol/L盐酸同法作空白对照。

2.3 白芷生物碱的提取

称取干燥至恒重的白芷粉末，采用乙醇提取法，分别在乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度4 种条件下进行回流提取，趁热过滤，滤液减压浓缩至白芷生物碱粗提取物。将白芷生物碱粗提物除杂，酸水相中缓滴加氨水等至溶液pH 8.5～9.5（精密pH试纸测定），等体积三氯甲烷萃取3 次，减压回收三氯甲烷，得白芷生物碱精提取物。用紫外分光光度法测定生物碱的含量，通过标准曲线计算提取样品溶液中白芷生物碱的浓度，按（1）式计算白芷生物碱提取率（mg/g）。

白芷生物碱生物碱提取率（mg/g）=

2.3.1单因素试验分别从提取温度、乙醇浓度、料液比、提取时间4 个因素来探讨影响白芷生物碱提取率的影响。

2.3.1.1 提取温度称取2.00 g白芷粉末5份，在65%乙醇溶液40.00 mL 恒定条件下，提取温度分别为40、50、60、70、80 ℃，提取时间3 h，检验提取液中白芷生物碱的含量，计算白芷生物碱提取率。

2.3.1.2 乙醇浓度称取2.00 g白芷粉末5份，在温度60 ℃恒定条件下，浓度分别为35%、50%、65%、80%、95%的乙醇40.00 mL，提取时间3 h，检验提取液中白芷生物碱的含量，计算白芷生物碱提取率。

2.3.1.3 料液比称取2.0 g 白芷粉末5 份，按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30分别加入20.00、30.00、40.00、50.00、60.00 mL 的65%乙醇溶液，提取时间3 h，检验提取液中白芷生物碱的含量，计算白芷生物碱提取率。

2.3.1.4 提取时间称取2.00 g白芷粉末5份，在提取温度60 ℃、65%的乙醇溶液40.00 mL恒定条件下，提取时间分别为1、2、3、4、5 h，检验提取液中白芷生物碱的含量，计算白芷生物碱提取率。

2.3.2正交试验优化以提取液中白芷生物碱的提取率作为考察指标分析。通过提取温度、乙醇浓度、料液比、提取时间为4个单因素，确定每个因素3个水平，以L9（43）正交试验设计对白芷生物碱提取工艺进行优化。

3 结果与分析

3.1 标准曲线

由图1 可知，以吸光度值为纵坐标（y），盐酸罂粟碱标准品溶液为横坐标（x），标准曲线方程为y=0.385 3x-0.004 8（R2=0.998 6），在0.25～2.00 µg/mL范围内，盐酸罂粟碱标准品溶液浓度与吸光度呈现良好的线性关系。

图1 标准曲线

3.2 白芷生物碱提取单因素试验

3.2.1温度对白芷生物碱提取率的影响由图2可知，在乙醇浓度65%，料液比1∶20（其中白芷粉末2.0 g，乙醇溶液40.0 mL），提取时间3 h条件下，随着温度的升高，白芷生物碱提取率不断增加，当温度达到70 ℃时，提取率为0.812 mg/g，达到最高值，随着温度继续升高，白芷生物碱提取率下降。提取温度的增加可以加快生物碱物质的溶出和扩散速率，使白芷生物碱的提取率增加，但过高的温度也会使部分生物碱分解[7]。综合考虑，以提取温度70 ℃为最佳提取温度。正交优化选择60、70、80 ℃作为下一步提取条件的温度。

图2 温度对白芷生物碱提取率的影响

3.2.2乙醇浓度对白芷生物碱提取率的影响由图3可知，在提取时间60 ℃，料液比1∶20（其中白芷粉末为2.00 g，乙醇溶液40.00 mL），提取时间3 h条件下，随着乙醇浓度的增加，白芷生物碱提取率增加，当乙醇浓度达到80%时，提取率为0.578 mg/g，达到最高值，随着乙醇浓度的继续增加，白芷生物碱提取率下降。这可能是因为65%乙醇溶液的极性与白芷生物碱类化合物极性相类似，利用其溶出，但乙醇浓度过高或过低时，也都会影响生物碱的溶出[6]。综合考虑，以乙醇浓度80%为最佳提取乙醇浓度。正交优化选择65%、80%、95%作为下一步提取条件的乙醇浓度。

图3 乙醇浓度对白芷生物碱提取率的影响

3.2.3料液比对白芷生物碱提取率的影响由图4 可知，试验以乙醇体积分数65%，温度60 ℃，提取时间3 h条件下，随着料液比的增加，白芷生物碱提取率增加，增加提取液的量有利于增加与样品的接触面积，利于生物碱的溶出。当料液比达到1∶25时，提取率为0.625 mg/g，达到最高值，随着料液比的继续增加，提取的量也变大，白芷生物碱提取率下降。综合考虑，料液比1∶25，为最佳提取料液比。正交优化选择料液比1：20、1∶25、1∶30作为下一步提取条件。

图4 料液比对白芷生物碱提取率的影响

3.2.4提取时间对白芷生物碱提取率的影响由图5 可知，在乙醇体积分数65%，料液比1∶20（其中白芷粉末为2.00 g，乙醇溶液40.00 mL），提取温度50 ℃条件下，随着提取时间的延长，白芷生物碱提取率增加，当时间达到2 h时，提取率为0.580 mg/g，达到最高值，随着提取时间的继续延长，白芷生物碱提取率下降。这可能是因为浸取初期，提取溶剂乙醇与白芷粉末接触不充分，且白芷生物碱由细胞内向外迁移也需要一定时间，当浸取时间达2 h后，浸取的速度变缓，在浸取较完全后，继续浸取可能使部分已溶出的白芷生物碱黏附在细胞壁上，从而阻碍了白芷生物碱的溶出，降低了白芷生物碱的提取率[8]。综合考虑，提取时间2 h为最佳提取时间。正交优化选择1、2、3 h作为下一步提取条件的时间。

图5 提取时间对白芷生物碱提取率的影响

3.3 白芷生物碱提取工艺优化

以温度、乙醇浓度、料液比、提取时间为4 个单因素，确定每个因素3 个水平（表1），以L9（43）正交试验设计对白芷生物碱提取工艺进行优化，其结果见表2、3。由表2、3可知，白芷生物碱提取正交试验中，各因素显著性均不显著，可直接根据极差分析选择最优水平组合。由表2 极差分析可知，影响白芷生物碱提取中，对生物碱提取率的影响由大到小以次为乙醇浓度（B）＞提取温度（A）＞时间（D）＞料液比（C）；乙醇法提取白芷生物碱的最佳工艺条件为A3B2C1D3，即提取温度80 ℃、乙醇体积分数80%、料液比1∶20、提取时间3 h。在此种条件下，测定白芷生物碱提取率为0.860 mg/g。

表1 白芷生物碱提取L9（34）正交试验因素水平

表2 白芷生物碱提取正交实验结果

表3 白芷生物碱提取正交试验方差分析结果

4 结论

本研究采用紫外分光光度法，以盐酸罂粟碱标准品为指标，测定白芷生物碱含量。采用乙醇提取法，在乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度4 种不同条件下，提取、粗品、再精制，在416 nm 处测定吸光度，来探讨的最佳提取率。通过单因素试验和L9（43）正交试验确定白芷生物碱的最佳提取工艺条件为：提取温度80 ℃、乙醇体积分数80%、料液比1∶20、提取时间3 h。在此工艺条件下，白芷生物碱提取量为0.860 mg/g。

本试验对白芷生物碱提取工艺进行了优化，得到了一种快速制备方法，节约了生产时间和成本，对白芷中提取生物碱具有参考意义。该研究可为后续白芷生物碱分离纯化、工艺放大、药理学研究和开发应用提供参考数据。